3.6.4微生物限度3.6.4.1方法验证材料与依据3.6.4.11供试品参榆.docVIP

3.6.4 微生物限度 3.6.4.1 方法验证材料与依据 3.6.4.1 1 供试品：参榆灌肠液 规格：XXX 生产企业：江苏省XXX医院 批号:111212 111214 111215 3.6.4.1.2 培养基： 1．营养琼脂培养基 批号：110512 厂家：XXX 2．玫瑰红钠琼脂培养基 批号：1105172 厂家：XXX 3．营养肉汤培养基 批号：110126 厂家：XXX 4．胆盐乳糖培养基 批号：110408 厂家：XXX 5．MUG培养基 批号：110203 厂家：XXX 3.6.4.1.3稀释剂: pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液 500ml/瓶, 批号：2011032801 (如缓冲液为市场购买，需写明生产企业) 3.6.4.1.4 菌种： 菌种名称 编号 来源 传代次数 大肠埃希菌 ( Escherichia coli) CMCC（B）44102 南京市药检所 第3代 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) CMCC（B）26003 南京市药检所 第3代 铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) CMCC（B）10104 南京市药检所 第3代 枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） CMCC（B）63501 南京市药检所 第3代 白色念珠菌 (Candida albicans) CMCC（F）98001 南京市药检所 第3代 黑曲霉 (Aspergillus niger) CMCC（F）98003 南京市药检所 第3代 3.6.4.1.5 验证依据：《中国药典》2010年版二部附录XI J微生物限度检查法方法验证。 3.6.4.2 验证实验操作 根据《中国药典》2010年版二部附录微生物限度检查法方法，采用常规法（如常规法回收率未达70%，需采用培养基稀释法重新进行验证；如培养基稀释法回收率仍未达70%，可采用薄膜过滤法再次进行验证）对细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。控制菌检查方法采用常规法（若阳性未生长采用培养基稀释法或薄膜过滤法），从而建立该样品的微生物限度检查方法。 3.6.4.2.1菌液制备方法： 1.接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中,置350C培养24小时，分别取上述培养物1ml加9ml 0.9％的无菌氯化钠溶液，10倍递增稀释制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。 2.接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，置250C培养48小时，取上述培养物1ml加9ml 0.9％的无菌氯化钠溶液，10倍递增稀释制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。 3.接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中,置250C培养7天，加入5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％的无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，并吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％的无菌氯化钠制成每1ml含孢子数为50～100cfu的孢子悬液。 3.6.4.2.2 供试液制备： 取供试品10ml,加pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,混均,作为1：10供试液。 3.6.4.3 菌落计数方法的验证 3.6.4.3.1 平皿法：（常规法） ①试验组：取1：10供试液1ml，分别加入10个平皿中，再依次加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉5种菌的菌悬液1ml(含50～100cfu)，每株菌平行制备2个平皿，立刻倾注营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，分别置350C培养48小时和250C培养72小时。 ②菌液组：分别取上述稀释的菌液1ml注入平皿内，每个菌平行制备2个平皿，测定所加的试验菌数。 ③供试品对照组：取1：10供试液1ml分别注入4个平皿中，立刻注入营养琼脂和玫瑰红钠琼脂培养基，每种培养基制备2个平皿，分别置350C培养48小时和250C培养72小时。以测定供试品的本底菌数。 上述方法平行实验3次 ④结果见表1 表1.参榆灌肠液细菌.霉菌和酵母菌回收率的测定（平皿法） 菌种类型 试验 次数 试验组 菌液组 供试品 对照组 回收率（%） 试验组 大肠 埃希菌 1 47 49 0 95.9 2 65 62 0 100 3 61 56 0 100 金 黄 色 葡萄球菌 1 36 33 0 100 2 44 45 0 97.8 3 45 41 0 100 枯草芽孢 杆