8高效液相色谱法..pptVIP

第八章高效液相色谱法 高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography, HPLC）又称高压液相色谱法。它是在经典色谱和气相色谱法的基础上发展起来的，在色谱理论方面没有本质的差别。但由于采用了高效固定相、高压输液泵、高灵敏度检测器等新技术，因而有了更高的效率并实现了自动化。 高压：150-350*105 Pa 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测） ①与经典色谱的比较 ②与气相色谱比较 以溶剂作流动相，流动相参与分离作用，分离能力强；适用范围广，气相色谱分离分析的化合物只占化合物的30％，而高效色谱对高沸点、热不稳定、大分子量、离子型化合物等都有效，适合于生命物质的分析；分析过程中一般不破坏物质，因而可以方便地制备色谱纯物质。 第一节 高效液相色谱的固定相和流动相 （－）固定相 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。 刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0×108～1.0×109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。 1.表面多孔型固定相 它的基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。 这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。 2．全多孔型固定相 它由直径为10μm的硅胶微粒凝聚而成。 这类固定相由于颗粒很细（5～10μm），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。 （二）流动相 由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。 （2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。下表列出了一些常用溶剂的紫外截止波长。 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。 第二节 高效液相色谱的主要类型和分类 2．固定相 3. 流动相 二 分配色谱和化学键合相色谱 1. 化学键合固定相 2. 正相键合相色谱法 3. 反相键合相色谱法 3. 离子性键合相色谱法 三、 离子交换色谱法 五、 体积排阻色谱 第三节 高效液相色谱仪 液相色谱仪（2） 液相色谱仪（3） 液相色谱仪（4） 流程及主要部件 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。 1. 储液罐（贮液槽）是用于贮存足够量的流动相的容器，常用材料为玻璃或不锈钢等。使用过程应密闭。 所用溶剂及样品在使用前应过滤。 2. 流动相脱气 HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测。（噪声增大，基线不稳，突然跳动）。此外，溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。溶解气体还会引起溶剂pH的变化，对分离或分析结果带来误差。 常用的脱气方法有：加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等。 对混合溶剂，若采用抽气或煮沸法，则需要考虑低沸点溶剂挥发造成的组成变化。 超声脱气比较好，10～20分钟的超声处理对许多有机溶剂或有机溶剂/水混合液的脱气是足够了（一般500ml溶液需超声20～30min方可），此法不影响溶剂组成。 离线（系统外）脱气法不能维持溶剂的脱气状态，在你停止脱气后，气体立即开始回到溶剂中。在1～4小时内，溶剂又将被环境气体所饱和。 在线（系统内）脱气法无此缺点。最常用的在线脱气法为鼓泡，即在色谱操作前和进行时，将惰性气体喷入溶剂中。严格来说，此方法不能将溶剂脱气，它只是用一种低溶解度的惰性气体（通