分辨率可达到0.2μm的光学显微镜.ppt

细胞生物学的 研究方法和手段 一、显微镜技术 二、细胞的分离和培养 三、细胞组分的分级分离 四、细胞内分子的示踪 五、分子生物学实验技术 显微镜技术 ㈠分辨率可达0.2μm的光学显微镜 ㈡分辨率可达2nm的电子显微镜 ㈢提示蛋白质精确结构的X线衍射 ㈣测定大分子结构的核磁共振 光学显微镜 1.普通光学显微镜 光学显微镜的参数 (1)分辨率(resolution，R)显微镜或人眼在25cm的明视距离处，能分辨被检物体微细结构最小间隔的能力。 0.61 λ R ＝ n · sinθ 0.61 λ R ＝ n · sinθ n :聚光镜和物镜之间 介质的折射率. 空气为1,油为1.5 θ :标本对物镜镜口 张角的半角. sinθ的最大值为1 λ :照明光源的波长. 白光为0.5 μm 显微镜分辨率计算： R＝0.61 ? / n · sin ? ＝0.61×0.5 ?m / 1.5×1 ＝0.2 ?m 人眼的分辨率：100 ?m 典型的动物细胞：10～20 ?m 一般的细菌和线粒体：0.5 ?m (2)最大放大倍数 人眼的分辨率(～ 100 ?m ) 光镜的分辨率(～ 0.2 ?m ) =～500倍 标 本 制 备 第一步.固定(fixation) 目的：使大分子交联而保持固定，不 至在后面过程中移位或丢失。 试剂：甲醛、戊二醛 机理：可与蛋白质的游离氨基形成共 价键，将邻近蛋白分子交联。 第二步.脱水 第三步.包埋（embed） 目的：包埋使组织变得坚硬,便于切片。 试剂：蜡、树脂 机理：可进入细胞内，起支持作用。 第四步.切片（section） 目的：切成薄片，便于切片黏附在载 玻片上进行染色。 仪器：切片机 切片厚度：1～10 ?m 第五步.染色（staining） 目的：使细胞成为可见. 方法： A.选择性染色 苏木精－细胞内核酸的分布 伊 红－细胞质染色 B.特异性染色 酶 + 底物 抗原 + 抗体 2.荧 光 显 微 镜 荧光的观察 1. 自发荧光 某些天然物质本身能发出荧光，如叶绿素。 2.二次荧光 ??非荧光性物质用荧光色素染色后，可产生 荧光（二次荧光），以便于进行观察 。 3.抗体荧光技术 ??带荧光标记的抗体与标本中的抗原结合， 这样就能通过抗体结合的荧光观察到抗原。 4.绿色荧光蛋白 图示： 鼠主动脉 平滑肌的 荧光染色。 核:blue 线粒体:green 肌动蛋白:red 免疫荧光显微镜技术（Immunofluorescence microscopy） ⑴原理: 荧光抗体与标本切片中组织或细胞 的抗原进行反应，在荧光显微镜下 可观察到明亮的特异荧光。 ⑵荧光素标记抗体的方法 ①直接法：荧光素直接和第一抗体偶联。 ②间接法：荧光素先和第二抗体(抗第一 抗体的抗体)偶联，再与第一抗体作用。 绿色荧光蛋白green fluorescent protein GFP ⑴发光原理: 蓝色光 GFP 绿色荧光 ⑵特点: 可在光镜水平，对特异蛋白质 等生物大分子进行定位及显示 一些细胞超微结构。 ⑶应用: a.特异蛋白质等大分子的定位 b.观察过氧化物酶体 特异蛋白质生物大分子定位 载体(GFP基因＋待定位蛋白基因) 导入特定的细胞 荧光显微镜下观察 待定蛋白质在细胞内的位置分布 观察过氧化物酶体 GFP ＋过氧化物体内的酶（有定位信号） 导入不同细胞 荧光显微镜下观察 各种细胞的过氧化物酶体 3.直视活细胞的相差显微镜 1.1953年诺贝尔物理奖 2.特点: 可用以观察活细胞。 3.原理: