细胞工程学实验指导简析.doc

实验一 细胞培养的基本技术 一、实验目的 1、了解细胞培养室的设置、设备和基本要求。 2、掌握细胞培养用器械的清洗、消毒方法及无菌操作技术。 二、实验材料 1、实验设备：高压灭菌锅、电子分析天平、pH计、超净工作台、滤器、滤泵。 2、实验器材：不同规格毛刷、烧杯、量筒、搅拌棒、瓷缸（陶瓷或玻璃）。 三、实验步骤 （一）器械的清洗 1、玻璃器皿的清洗（植物细胞培养只需①、②操作即可）： ①清水浸泡：浸泡主要是软化器皿表面所附着的物质。 ②刷洗：将浸泡后的玻璃器皿在洗涤剂中用毛刷反复刷洗，以除去器皿表面的杂质。烘干备用。 ③浸酸：将经过刷洗和烘干后的玻璃器皿浸泡在由重铬酸钾、浓硫酸配置而成的清洁液中，利用强氧化作用清除瓶皿表面可能残留的有机物。浸泡时间要在6小时以上，最好过夜（用于动物细胞培养）。 ④冲洗：浸酸后的器皿从洗液中取出后，用自来水冲洗10遍以上。再用蒸馏水、三蒸水各清洗3遍以上，取出置于烤箱内（40~50℃）烘干（用于动物细胞培养）。 2、金属器械的清洗和消毒：金属器械不能在清洁液中浸泡，一般用洗涤剂洗刷干净后，再用自来水和蒸馏水反复冲洗干净，烘干。 3、胶塞的清洗和消毒：细胞培养中使用的胶塞不能用清洁液浸泡。清洗过程中，要先在水中浸泡，然后2%NaOH溶液煮沸10分钟。自来水冲洗晾干后，再用1%的稀盐酸浸泡30分钟，最后再用自来水、蒸馏水、三蒸水进行常规清洗，烘干备用。注意使用后的胶塞应及时浸泡在清水中。 4、塑料物品的清洗：塑料物品用后立即用流水冲净或浸入清水中，防止干涸。一般不用刷洗以防划痕和损伤。清洗干净的器皿先在2%NaOH溶液浸泡过夜，自来水冲洗晾干后，再用1%的稀盐酸浸泡30分钟。最后再用自来水、蒸馏水、三蒸水进行常规清洗，烘干备用。 注：清洁液的配制（盛装于瓷缸中，用于动物细胞培养时玻璃器皿的清洁） 成分 强酸溶液 次强酸溶液 弱酸溶液 重铬酸钾（g） 浓硫酸（ml） 蒸馏水（ml） 63 1000 200 120 200 200 100 100 1000 （二）器械的消毒灭菌 造成细胞培养失败的主要原因是发生污染，特别是微生物的污染，因此对细胞培养中所用的器械进行消毒灭菌是非常重要的。最常用的物理消毒方法有如下几种： 1、紫外线消毒：紫外线是一种低能量的电磁辐射，可以杀灭多种微生物。目前，多用紫外灯直接照射培养室内空气、地面、工作台表面等进行消毒。 2、高温干热灭菌：一般在烤箱中进行，主要用于消毒玻璃器皿。干热灭菌后的器皿干燥，易于存放。但是，干热传导慢，可有冷空气存留于烤箱内，需要较高的温度和较长的时间才能达到消毒的目的，因此需加温到160℃，保持90-120℃分钟。消毒后不可马上将烘箱门打开，以免冷空气进入，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外。 3、压力蒸汽灭菌：一般使用高压蒸汽灭菌锅进行。为保证消毒的效果，待消毒的物品不应装得太满，以便消毒器内空气流通。在加热升压之前，打开排气阀门，以使加热后消毒器内的冷空气排出。冷空气排完后，关闭排气阀门，开始升压，待达到所需压力后，开始计时，一般为100KPa、121℃下灭菌20分钟。消毒完毕后，不要立刻打开盖子，应先等压力自行下降到一定程度后，打开排气阀，放气后，再打开消毒器的盖，将物品取出，放入烤箱内烘干。 4、过滤除菌：是将液体或气体用具有微孔的薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌的目的。目前，多数实验室采用微孔滤膜滤器除菌，滤膜孔径为0.22~0.45μm。表1-1 常用消毒剂消毒灭菌效果比较表 消毒剂 使用浓度（%） 去除的难易 消毒时间（min） 效果 次氯酸钙 次氯酸钠 漂白粉 溴水 过氧化氢 升汞 酒精 抗生素 硝酸银 9~10 2 饱和浓度 1~2 10~12 0.1~1 70~75 4~5（mg/L） 1 易 易 易 易 最易 较难 易 中 较难 5~30 5~30 5~30 2~10 5~15 2~10 0.2~2 30~60 5~30 很好 很好 很好 很好 好 最好 好 较好 好 无菌材料进行接种或传代时，必须从各方面防止任何污染物进入容器，所以接种区的消毒至关重要。由于接种区的污染源主要是空气中的细菌和真菌孢子，因此长期停用后的无菌操作室应进行熏蒸消毒灭菌（常用每立方米含2ml甲醛和1g高锰酸钾的消毒液或6ml/m3乙二醇等加热熏蒸）。每次接种前都应进行地面卫生清洁，并用紫外灯照射20min，进行空气的消毒灭菌。对接种用的超净工作台，每次接种前用紫外灯照射20min，同时用70~75%酒精擦洗，然后方可进行培养材料的接种。 （五）无菌操作 培养实验二 动物细胞培养基的配制 一、实验目的 1、掌握含血清细胞培养液的配制方法。 2、掌握胰蛋白酶溶液的配制方法。 二、实验材料 1、实验设备：