猪瘟的间接免疫荧光实验.pptVIP

实验五 猪瘟的间接免疫荧光实验龙岩学院生命科学学院2015.5.25 一、实验目的： 了解和掌握猪瘟的临床诊断方法和实验室诊断方法（间接免疫荧光法）。 荧光免疫显微技术 直接法---荧光素标记Ab直接检测 间接法---荧光素标记二抗 补体结合法---荧光素标记抗补体Ab 双结合法---两种荧光素标记Ab 二、实验原理： 固定在载片上的待检病变组织与适当稀释的猪瘟阳性血清反应后，如果待检组织中有猪瘟病毒抗原就会与猪瘟阳性血清中的抗体特异性结合，加入FITC(异硫氰酸荧光素)标记的的兔抗猪IgG二抗又可与猪瘟阳性抗体特异性结合，在荧光显微镜下可见呈现绿色荧光。 荧光二抗 三、试剂与仪器： 1.猪瘟病料、抗原片、FITC荧光标记的兔抗猪二抗、PBS缓冲液、猪瘟标准阴、阳性血清、封片介质:磷酸盐缓冲甘油、盖玻片、滤纸 2.荧光显微镜、摇床、移液器、吸管等 荧光显微镜： 四、IIF操作步骤： １．准备：取病猪的扁桃体，淋巴结、脾或其他组织一小片，用滤纸吸去外面的液体。用笔编号、标记。 ２．触片：取干净载玻片一块，稍为烘热，将组织小片的切面触压玻片，略加转动，作成压印置室温内干燥。或用所采的病理组织，做成切片。 固定：滴加冷丙酮数滴，置–20℃固定15一20分。 清洗：用PBS（pH7.2）洗涤3次，每次5 min，阴干。 第一次温育：滴加25ul稀释后的血清覆盖触片样品