HIV感染的实验室检测__培训课件.pptVIP

（三）筛查试验步骤 根据检测目的选用符合要求的筛查试剂对样品进行初筛和重复检测（复检） 初筛试验：以第三代ELISA（双抗原夹心法）梅里埃试剂为例。 （1）实验准备：试验开始前将试剂和样品放置在室温(18?23℃), 按实验室SOP做好试剂准备。 磷酸盐缓冲液：若液体内有结晶,应放置在37℃直至溶解，用蒸馏水1：25稀释浓缩液，4℃保存2周。 TMB底物液：使用前配制，TMB液和过氧化脲液等量混匀。 1M硫酸终止液：85 ml蒸馏水中加入5 ml浓硫酸。 备好试剂盒、待检样品和外部对照质控血清后，按试剂盒说明书以及质控和安全防护要求进行筛查检测。 （2）实验操作 ①装好所需使用数目的孔条,每孔均加入100μl样品稀释液。设3个阴性对照孔，1个HIV-1阳性对照孔，若需要可再设1个HIV-2阳性对照孔。 ②每孔加入50μl待检样品及对照（对照要后加），未用孔用样品稀释液加满以溶解结合物球，以免堵塞洗板机孔。可震摇15S，37±2℃孵育60±5min。 ③置洗板机上洗涤6遍（用洗液将反应孔完全加满,静置30?60S,共洗涤6遍，洗完后孔上方及底部不应残存液体.）。 ④每孔加入100μl底物液，勿搅动，室温避光孵育30±2min。 ⑤每孔加入100μl 1M硫酸终止反应，充分混匀。 ⑥在2h内置于酶标仪读数，单波长450nm，或双波长450/630nm测OD值。 （3）实验结果 ①阴性对照（NC），HIV-1阳性对照（PC1），HIV-2阳性对照（PC2） NC 必须＜0.25方可用，排除NC≥0.25的值，计算NC平均值。 NC界限范围：0.6倍NC均值＜NC＜1.4倍NC均值。 ②符合以下条件的实验成立： 两个以上的NC可用。 PC1-NC均值 ≥ 0.4，PC2-NC均值 ≥ 0.4 ③Cut off值 = 阴性对照均值 + 0.100 小于Cut off为阴性，大于或等于Cut off为阳性 （4）报告：对呈阴性反应的样品，可由实施检测的实验室出具HIV抗体阴性报告；对呈阳性反应的样品，须进行复检，不能出阳性报告。 （四）检测要点 1、筛查试验阳性不能出阳性报告 2、严格按照试剂说明书操作，不得擅自更改。 3、注意防止交叉污染。 4、严格遵守实验室标准操作规程（SOP）。 （五）检测程序及流程图 1、筛查试验 标本验收合格后，用筛查试剂进行检测，如呈阴性反应，报告HIV抗体阴性；对呈阳性反应的标本，须进行重复检测。 2、重复检测 对筛查呈阳性反应的标本用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的试剂重复检测。如两种试剂复测均呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确认实验室进行确认。应尽可能将重新采集的受检者血液标本和原有标本一并送检。 （六）初筛试验结果的报告 对HIV抗体筛查试验，呈阴性反应者可出具“HIV抗体阴性”报告（可用附表1）；对初筛试验呈阳性反应者不能出阳性报告，可出具“HIV抗体待复查”报告（附表1）。 筛查试验的流程图 样品 样品 筛查检测 筛查试剂 阳性反应 阴性反应 原有试剂加另外一种筛查 试剂 重复检测 一阴一阳 均阴性反应 均阳性反应 阴性报告 送确认实验室 进行确认 谢 谢 * * HIV抗体检测原理和方法 石嘴山市疾控中心 艾滋病初筛中心实验室 HIV感染的实验室检测 常用HIV病原学检测方法: 病毒分离 抗原检测 核酸检测（ cDNA测定-PCR、 RNA测定-病毒载量） 其他方法：逆转录酶测定、原位杂交 常用HIV抗体检测方法: ELISA 快速HIV检测 免疫印记法 （ Western Blot） 其他方法：免疫荧光法（IFA）、放射免疫沉淀实验 抗原检测的目的 （一）检测早期感染，缩短窗 口期 （可提前1-2周） HIV-P24抗原阳性仅作为HIV 感染窗口期的辅助诊断依据， 不能据此确诊 （二）新生儿的感染 婴幼儿HIV抗体阳性不能用于诊断感染HIV 婴幼儿体内从母亲得到的HIV抗体持续存在时间最长不超过18个月。 在18月龄以前可以用多种不同的非抗体依赖性的检验方法对新生儿HIV感染进行辅助诊断，包括：HIV P24抗原检测、病毒分离培养、RNA或DNA测定。 18月龄以前婴幼儿感染HIV诊断要结合临床表现和实验室综合诊断。 抗体检测的目的 输血和移植安全（为了接受者的安全） 监测(为了知晓人群流行状况) 临床HIV疾病的诊断 (为了知晓个体感染状况） 为了达到以上的某个目的的HIV 检测可能不适合其他目的，比如输血服务的检测不适合临床诊断HI