微生物试验基本操作.docVIP

常用的基本操作技术 （一）消毒和灭菌技术 消毒（disinfection）与灭菌（sterilization）两者的意义有所不同。消毒一般是指利用物理或化学方法消灭病原菌或有害微生物的营养体，而灭菌则是指利用强烈的物理或化学方法杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子。但日常生活中两者常常通用。灭菌的方法很多，一般可分为物理灭菌和化学灭菌两大类。 1. 物理灭菌 物理灭菌是最常用的灭菌方法。主要包括热力学灭菌、过滤除菌和紫外线灭菌等。 （1）热力学灭菌 又可分为干热灭菌和湿热灭菌两大类。 ①干热灭菌 干热灭菌是利用高温使微生物的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质的凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快；含水量越小，凝固减慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度更高（160~170℃），时间更长（1~2h）。进行干热灭菌时最高温度不能超过180℃，否则，包扎器皿的纸或棉塞就会被烤焦，甚至引起燃烧。通常所说的干热灭菌是指利用干燥箱（或称烘箱）进行灭菌，主要用于玻璃器皿如培养皿、移液管和接种工具等的灭菌。灭菌时将被灭菌的物体用双层报纸包好或装入特制的灭菌筒内，装入箱中，不要摆的太挤，以免妨碍热空气流通。逐渐加温，使温度上升至160～170℃后保持2h。灭菌结束后，切断电源，自然降温，待箱内温度降至70℃以下后，才能打开箱门，取出灭菌物品。注意在温度降至70℃以前切勿打开箱门，以免玻璃器皿炸裂。 另外，灼烧灭菌也属于干热灭菌。在进行无菌操作时，接种工具如接种环、接种钩、接种铲、镊子等要在酒精灯火焰上充分灼烧，试管口、菌种瓶口在火焰上作短暂灼烧灭菌等。 ②湿热灭菌 a.高压蒸汽灭菌 此法是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性达到灭菌的目的。 在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大，三是湿热的蒸汽有潜热存在。1g水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。 在使用高压蒸汽灭菌锅时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。 一般培养基用0.11MPa，121℃，20～30min可达到彻底灭菌的目的。 这种灭菌适用于培养基、工作服、橡胶制品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。 b.常压蒸汽灭菌法 在不具备高压蒸汽灭菌的情况下，常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌方法。对于不易用高压灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等可采用常压蒸汽灭菌。这种灭菌方法可用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌，也可用普通蒸汽笼进行灭菌。由于常压，其温度不超过100℃，仅能使大多数微生物被杀死，而芽孢细菌却不能在短时间内杀死，因此可采用间歇灭以杀死芽孢细菌，达到彻底灭菌的目的。 常压间歇灭菌是将灭菌培养基放入灭菌器内，每天加热100℃，30min，连续3d，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养物取出放室温下18~24h，使其中的芽孢发育成营养体，第二天再加热100℃，30min，发育的营养体又被杀死，但可能仍留有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。 c.煮沸消毒法 注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般微生物学实验室中煮沸消毒时间为10～15min，可以杀死细菌所有营养体和部分芽孢。如延长煮沸时间，并加入1%碳酸氢钠或2%～5%石炭酸，效果更好。人用注射器和手术器械均采用高压蒸汽灭菌或干热灭菌，或采用一次性无菌用品。 d.超高温杀菌 超高温杀菌(ultra high temperature sterilization，简称UHTS)是指在温度和时间标准分别为130～150℃和2～8s的条件下对牛乳或其他液态食品(如果汁及果汁饮料、豆乳、茶、酒及矿泉水等)进行处理的一种工艺，其最大优点是既能杀死产品中的微生物，又能较好地保持食品品质与营养价值。超高温杀菌工艺地应用，使乳制品及各种饮料等无需冷藏的理想变成了现实。从而打破了地域和季节地限制。 超高温杀菌是自80年代以来已在世界各国广泛应用。我国改革开放以来，超高温杀菌也广泛应用于橘子汁、猕猴桃汁、荔枝汁、菊花茶、牛乳等生产。 （2）过滤除菌 许多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加热灭菌消毒灭菌方法，均会被热破坏，因此可以采用过滤除菌方法。应用最