细胞生物学 03 细胞生物学研究方法.ppt

主要内容 显微镜技术 显微镜技术 光学显微镜技术 电子显微镜技术 SEM（scanning electron microscope） TEM（transmition electron microscope） 扫描隧道显微镜 一、光学显微镜技术 以可见光（或紫外光）为光源 类型 普通复式光学显微镜 特殊光学显微镜：相差和微分干涉显微镜、录像增差显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜、倒置显微镜等 多功能显微镜 激光扫描共焦显微镜 1、普通复式光学显微镜 构成： 性能参数： 分辨率 放大率 特点和局限性 （1）普通复式光学显微镜性能参数 分辨率：区分开两点间的最小距离 R=0.61λ/nsin(α/2) NA=nsin(α/2) NA(numerical aperture)为物镜的数值孔径值 影响分辨率的因素 入射光的波长 镜口角 介质的折射率 （2）普通复式光学显微镜特点和局限性 特点：明视场显微镜是以标本的颜色及其透射率为基础的显微镜。 一般需要对处理过的样品（固定染色）进行观察 以可见光为光源（波长范围400nm-700nm） 局限性 难以观察活的样品 分辨能力有限 能不能用光学显微镜观察活细胞呢？ 2、活细胞观察技术 相差显微镜 微分干涉显微镜 录像增差显微镜 倒置显微镜 （1）活细胞观察技术—相差显微镜 原理：把透过标本的可见光的光程差（相位差）变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。 特殊构造：相差物镜、环形光阑、合轴调中望远镜、绿色滤光片 相差显微镜的应用 特点：可以对无色透明的标本进行观察。适合于观察未经染色的活细胞。 （2）活细胞观察技术—微分干涉显微镜 特点：以平面偏振光为光源，能区分样品厚度的微小差别，增加样品反差，有立体感。 应用：观察未染色标本，更适于研究活细胞中较大的细胞器 （3）录像增差显微镜—计算机辅助的微分干涉显微镜 降低背景噪声，提高分辨率，填补光镜与电镜之间的空白 （4）活细胞观察技术—倒置显微镜 应用：通常具有相差物镜，用来观察正在培养的活细胞 3、特殊光学显微镜—荧光显微镜 光源：汞灯—短波长紫外光 装置：激发滤光片、阻断滤光片、分色镜 荧光染料染色 应用：在光镜水平对细胞中特异的蛋白质分子或核苷酸片段等进行定位、定性分析。 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP ） 3、特殊光学显微镜—荧光显微镜 4、光学显微镜—激光扫描共焦显微镜 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描，排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 用途类似荧光显微镜，可自动改变观察的焦平面,通过“光学切片” 观察较厚样品的内部结构，并可通过三维重构,形成立体图像。 在研究亚细胞结构与组分方面应用广泛. 4、光学显微镜—激光扫描共焦显微镜 光学显微镜—激光扫描共焦显微镜 5、与荧光观察有关的技术 6、特殊显微镜—暗视野显微镜 原理：通过在明场显微镜上安装暗场聚光镜，使来自聚光镜的光线不直接入射到物镜内，而被标本散射的光则可以进入物镜，从而达到在黑暗的背景下可看到标本的外部形态。 特点 视野是暗的，物象是亮的。 可以观察在明视场中看不见的细菌等微小标本的存在。 只能看清标本轮廓，分不清内部结构 7、多功能显微镜 二、电子显微镜 以电子束作为光源 扫描电子显微镜利用二次反射电子成像，主要用来观察样品表面的形态特征。 透射电子显微镜利用透过的电子成像，用来观察细胞内部的详细结构。 二、电子显微镜 1、基本构造 电子束照明系统： 成像系统：电磁透镜 真空系统： 记录系统：荧光屏或感光胶片 二、电子显微镜 2、电子显微镜的优缺点 优点：比光学显微镜分辨率高 缺点：不能观察活的生物样品，而且不能观察细胞全貌。 二、电子显微镜 3、电子显微镜制样技术 超薄切片技术（厚度40～50nm） 电镜负染色技术 冷冻断裂和冷冻蚀刻技术 电镜三维重构技术 三、扫描隧道显微镜 分辨率：横向为0.1～0.2nm，纵向可达0.001nm。 用途：是探测微观世界物质表面形态的仪器，三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。可直接观察生物大分子生物结构的原子排列，并且可避免损伤样品。 工作原理 三、扫描隧道显微镜 细胞组分的分析方法 细胞组分的分离 细胞组分的分析 定量细胞化学技术 一、细胞组分的分离 细胞组分的获得：用低渗匀浆、超声破碎、研磨等方法获得细胞组分匀浆。 细胞组分分离—离心技术：离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。 常用差速离心技术、密度梯度离心技术，或者是二者结合。 一、细胞组分的分离 1、差速离心 2、密