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专题九：DNA技术与人类基因组 【竞赛要求】 DNA操作的工具 质粒是基因的载体 内切酶与连接酶 基因克隆 反转录 DNA探针 PCR技术 人类基因组 DNA技术的应用 10．DNA技术带来的危害与伦理问题 【知识梳理】 一、基因工程概述 基因工程：是在分子生物学和分子遗传学综合发展基础上于本世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术科学。一般来说，基因工程是指在基因水平上的遗传工程，它是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质--DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源遗传物质在其中安家落户，进行正常复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。 这个定义表明，基因工程具有以下几个重要特征：首先，外源核酸分子在不同的寄主生物中进行繁殖，能够跨越天然物种屏障，把来自任何一种生物的基因放置到新的生物中，而这种生物可以与原来生物毫无亲缘关系，这种能力是基因工程的第一个重要特征。第二个特征是，一种确定的DNA小片段在新的寄主细胞中进行扩增，这样实现很少量DNA样品拷贝出大量的DNA，而且是大量没有污染任何其它DNA序列的、绝对纯净的DNA分子群体。 二、细胞是DNA操作必不可少的工具 （一）质粒是基因的载体 基因载体或称克隆载体。这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。可充当克隆载体的DNA分子有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA。 细菌质粒是独立于细菌拟核中DNA分子的自主复制的环状双链DNA分子，是基因工程最常用的运载体。最常用的质粒是大肠杆菌的质粒。大肠杆菌的质粒中常含有抗药基因，如抗四环素的标记基因。细菌质粒的大小只有普通细菌拟核DNA的百分之一左右。质粒能够“友好”地“借居”在宿主细胞中。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。但是，质粒的复制则只能在宿主细胞内完成。土壤农杆菌的质粒常用于培育转基因植物。 （二）工具酶 1．限制性内切酶：识别特异序列，切割DNA 2．DNA连接酶：催化DNA中相邻的5′磷酸基与3′羟基间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合，连接DNA片段 3．DNA聚合酶Ⅰ： （1）合成双链cDNA中第二条链 （2）缺口平移制做探针 （3）DNA序列分析 （4）填补3′末端 4．Taq酶 : 催化PCR反应，聚合DNA 5．反转录酶: a.合成cDNA。b.替代DNA聚合酶Ⅰ进行填补，标记或DNA序列分析 6．多聚核苷酸激酶: 催化DNA 5′羟基末端磷酸化，或标记探针 7．碱性磷酸酶: 切除DNA5′末端磷酸基 8．末端转移酶: 在3′羟基末端进行同系多聚核苷酸加尾 9．DNA酶: 切割DNA 10．RNA酶: 切割RNA 在所有工具酶中，限制性核酸内切酶具有特别重要的意义。所谓限制性核酸内切酶就是识别 DNA的特异序列，并在识别点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。根据酶的组成，所需因子及裂解DNA方式的不同，可将限制性核酸内切酶分为三类。重组DNA技术中常用的限制性核酸内切酶为Ⅱ类酶，大部分Ⅱ类酶识别DNA位点的核苷酸序列呈二元旋转对称，通常称这种特殊的结构顺序为回文结构。 　　下面小结限制性内切酶 　　Ⅰ类 　　需 Mg 2+、SAM及ATP 　　识别位点复杂，特异性差，切割位点距识别点远。 　　Ⅱ类 　　仅需 Mg 2+ 　　识别切割特异性强，切割发生在识别位点。 　　Ⅲ类 　　需 Mg 2+及ATP 　　切割位点在识别位点周围，酶活性不单一。 （三）基因克隆 1．概念：DNA克隆就是应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆又称重组DNA。 2．重组 DNA的基本原理 　　一个完整的DNA克隆过程应包括：①目的基因的获取，②基因载体的选择与构建，③目的基因与载体的拼接，④重组DNA分子导入受体细胞，⑤筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞（转化子）。 　（1）目的基因的获取 　　目前获取目的基因大致有如下几种途径或来源。 　　a．化学合成法：如果已知某基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出该多肽编码基因的核苷酸序列，再利用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。 　　b．基因组DNA：采用物理方法(剪切或超声波)或限制性内切酶将染色体DNA切割成许多片段，然后将它们与适当克隆载体结合，将重组DNA转入