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第三章 基因工程制药 基因工程的基础知识 第一节 基因的概念与特性 一、基因的概念: 　DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列,是遗传物质的最小功能单位。 早期认为遗传物质是蛋白质，1944年Avery从肺炎链球菌转化实验证明是DNA。 / A：S有夹膜致病菌，B：R突变非致病菌，C：加热杀死S菌，D：活R死S 二、基因的一般特性： ①基因可自我复制， ②基因决定蛋白质结构， ③基因可突变。 基因按功能分为： ①结构基因 ②调控基因 三、DNA的结构与性能 ⒈DNA的结构：四种核苷酸（A T C G）连接。 DNA二级结构双螺旋结构。 ⒉DNA的性质与功能 ①吸收光谱260 ②电场中泳动 ③变性 复性 杂交 第二节 DNA的复制与表达 一、DNA的复制： 　　半保留复制 二、基因表达 ⒈转录：在RNA聚合酶的催化下以DNA　　为模板合成mRNA的过程。 转录后加工： 剪切：除去内含子 加帽：5’加m7Gppp 加尾：3’加poly（A） 二、翻译：以mRNA为模板,tRNA作为运载工具,将活化的氨基酸在核糖体上合成蛋白质的过程。 ⒈分为三个阶段： ①起始 ②延长 ③止 基因表达 真核细胞的翻译过程 ⒉翻译后的肽链加工 肽链切断 ①羟基化 ②糖基化 ③磷酸化 ④乙酰化 基因工程制药 第一节 概 述 20世纪70年代基因工程诞生最先应用在医药科学领域。 1982年第一个基因工程产品--人胰岛素在美国问世。 优点:大量生产、应用临床、深入研究、扩大应用、改造不足 。 第二节 基因工程药物生产的基本过程 基因工程技术是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。 基因工程基本过程 基因工程药物制药的主要程序: ⒈目的基因的克隆， ⒉构建DAN重组体， ⒊DAN重组体转入宿主菌， ⒋构建工程菌， ⒌工程菌发酵， ⒍表达产物的分离纯化， ⒎产品的检验等。 基因工程药物制药的主要程序 获得目的基因 组建重组质粒 构建工程菌（或细胞） 培养工程菌 产物分离纯化 除菌过滤 半成品检定 成品检定 包装 第三节 目的基因的获得 克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法。 一、逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，在反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。 ⒈mRNA的纯化 ⒉cDNA第一链的合成 ⒊cDNA第二链的合成 ⒋ cDNA的克隆 ⒌将重组体导入宿主细胞 ⒍ cDNA文库的鉴定 ⒎目的cDNA克隆的分离和鉴定 二、化学合成法 较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。 必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。 用化学法合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。 人工化学合成基因的限制有： ⒈不能合成太长的基因。目前 DNA 合成仪所合成的寡核苷酸片段仅为 50～ 60 bp，因此 只适用于克隆小分子肽的基因。 ⒉遗传密码的简并使选择密码子困难，用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完全一致，易造成中性突变。 ⒊费用高。