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Ni Smart Beads 目录 产品介绍………………………………………………………………….……..1 纯化流程………………………………………………………………………...1 在位清洗………………………………………………………………………...2 问题及解决方案……………………………………………………………….3 订购信息及相关产品…………………………………………………………3 1. 产品介绍 Ni Smart Beads 是一种新型 IMAC 填料，螯合有非常牢固的 Ni 离子. 具体性能见表 1。 Ni Smart Beads 主要应用于分泌到真核培养液上清中的组氨酸标记蛋白的捕获和纯化，可以在含有 EDTA 及 DTT 的情况下进行目的蛋白高效的纯化。Ni Smart Beads 有很强的组分兼容性，适用于广泛底物及盐浓度的缓冲条件，试剂耐受情况见表 2。 表 1. Ni Smart Beads 产品性能对比 Ni Smart Beads 基质 高度交联的 6%琼脂糖微球 载量（/mL 基质） ~10mg 6XHis-tagged protein 微球粒径（μm） 45–165 最大压力 0.3 MPa, 3 bar 储存缓冲液 含 20% 乙醇的 1XPBS 储存温度 4°C-30°C 表 2. Ni Smart Beads 试剂耐受情况 试剂种类 0.01M HCl ,0.01M NaOH 一周 10mM EDTA,1M NaOH, 5mM 24 小时 DTT, 5mM TCEP, 20mM 巯基乙 醇, 6M 盐酸胍 500mM 咪唑，100mM EDTA 2 小时 30%异丙醇 20 分钟 2. 纯化流程 2.1 Buffer 的准备 Buffer 可使用下列推荐 Buffer，也可根据自己的使用习惯配置不同的缓冲液体系，基本原理就是低咪唑上样，高咪唑洗脱，或者高 pH 上样，低 pH 洗脱。Buffer 在使用前最好用。 0.2 2μm 或者 0.45 μm 滤膜过滤除菌。 平衡液：20mM 磷酸盐，0.5M NaCl，pH7.4 洗杂液：20mM 磷酸盐，0.5M NaCl，0-30mM 咪唑，pH7.4 洗脱液：20mM 磷酸盐，0.5M NaCl，500mM 咪唑，pH7.4 注：为了减少宿主细胞蛋白的洗脱，建议在洗杂液中溅入低浓度的咪唑。为了消除一些离子作用蛋白的吸附，可以在溶液中加入 0.5M-1.0M NaCl。 可以采用低 pH 值洗脱或与咪唑结合，如 pH2.5-5.0。, 2.2 样品准备 1) 将细胞培养液转移至离心杯，7,000rpm，离心 15min 取上清。如果使用预装柱，样品 在使用前最好用 0.22μm 或者 0.45 μm 滤膜过滤除菌。 2) 样品中含有可耐受范围内试剂，不需要透析或浓缩，可以直接上样。 2.3 样品纯化流程 Ni Smart Beads 装填好后，可以用各种常规的中压色谱系统，以?KTA 仪器使用为例介绍其使用方法。 1). 将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子，将层析柱连接至色谱系统中，打开下出口，将预装柱接到色谱系统中，并旋紧。 2). 用 3-5 倍柱体积的去离子水冲洗出储存缓冲液。 3). 使用至少 5 倍柱床体积的 Lysis Buffer 平衡色谱柱。 4). 利用泵或注射器上样。注:样品的粘度增加使得即使上样体积很少，也会导致层析柱很大的反压。上样量不要超过柱子的结合能力。大量的样品体积也可能造成很大的反压，使得进 样器更难使用。 5). 用 Wash Buffer 冲洗柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线（一般至少 10-15 个柱 体积）。注：在样品和结合缓冲液中加入咪唑可以提高样品纯度。 6). 用 Elution Buffer 采用一步法或线性梯度洗脱。一步洗脱中，通常 5 倍柱体积洗脱液就足够了。可以用一个小的梯度，例如 20 倍柱体积或更多，来分离不同结合强度的蛋白质。 2.4 SDS检测 将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用 SDS检测纯化效果。 3. 在位清洗 当填料使用过程中发现反压过高或者填料上面出现明显的污染时，需要进行在位清洗操作 （Cleaning-in-Place，CIP）。 建议按照下面操作去除填料上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏