稳斑汤对apoe基因敲除小鼠动脉粥样硬化不稳定斑块的治疗作用.doc

稳斑汤对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化不稳定斑块的治疗作用 【摘要】 目的 通过观察LC3和casepase-3表达水平来论证稳斑汤对小鼠动脉粥样硬化不稳定斑块的治疗作用。方法 建立ApoE基因敲除小鼠[ApoE (-/-)小鼠]动脉粥样硬化模型小鼠，随机分为5组每组12只，即模型组、稳斑汤低剂量组、中剂量组、高剂量组及西药组，采用HE染色，Masson染色法用于实验观察，逆转录聚合酶链反应 ( RT -PCR )和免疫组织化学法检测腹主动脉组织中LC3蛋白和casepase-3mRNA的表达水平。 结果 与模型组比较，中药各剂量组、西药组ApoE (-/-)小鼠腹主动脉组织中LC3的蛋白表达水平显著升高（P0.01），casepase-3 mRNA表达水平显著降低（P0.01） 结论 稳斑汤对小鼠动脉粥样硬化不稳定斑块有治疗作用。 【关键词】 稳斑汤；LC3；casepase-3（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶）；不稳定斑块 近年来，动脉粥样硬化（AS）性心血管疾病成为了威胁人类健康的第一杀手，通过对该病长期的研究，世界医学领域提出了各种发病机制与治疗方案。LC3蛋白是酵母自噬相关蛋白（Atg)8类似物，可转换为LC3-I（18kDa)及LC3-II(16kDa) ，是目前检测自噬的重要标志蛋白，广泛用于自噬过程的检测[1]。Casepase-3是细胞凋亡的重要调控基因，是细胞凋亡的敏感指标，casepase-3表达与细胞凋亡指数呈正相关，从而阻抑casepase-3启动而发挥抗细胞凋亡作用。本文通过观察稳斑汤对ApoE (-/-)小鼠腹主动脉中LC3和casepase-3表达水平来论证稳斑汤对小鼠动脉粥样硬化不稳定斑块的治疗作用，在临床治疗中用风痰理论来治疗AS，提供了理论依据。 1 实验材料与方法 1.1实验药品及制备稳斑汤：全蝎5g，蜈蚣1条，地龙10 g，水蛭15g，陈皮15g，半夏15g，白术15g。由辽宁中医药大学附属医院中药局提供，加工制成含生药2g/ml中药浓缩液备用。对照药阿托伐他汀钙片：生产厂家是辉瑞制药有限公司，10mg/片，国药准字号： 1.2 实验动物 1.2.1 6-8周龄ApoE (-/-)小鼠70只， 雌雄各半，SPF级，体重18g-20g，饲以高脂饲料十三周，随机处死4只，取腹主动脉根部，HE染色观察基础AS硬化程度，确定造模成功。 1.2.2 将造模成功的小鼠60只随机分为5组每组12只，即模型组、稳斑汤低剂量组、中剂量组、高剂量组及西药组，继续给予高脂饲料喂养；正常小鼠12只设为空白对照组，给予普通饲料喂养。 1.2.3 空白对照组和模型组小鼠给予0.3mL/日的生理盐水；根据成人每日用药临床推荐的常用剂量，按成人与小鼠的体表面积折算系数0.0026折算成小鼠用量：稳斑汤低剂量组6.175g/kg/日、中剂量组12.35g/kg/日、高剂量组24.7 g/kg/日，西药组（阿托伐他汀钙片）27.3mg/kg/日。灌胃给药，每日1次。给药13周，取腹主动脉，进行病理观察。 1.2.4 实验取材 经小鼠眼眶静脉丛采血，离心分离血清，-80℃冻存,处死全部小鼠，无菌条件下取出心脏及腹主动脉，心脏10%甲醛固定，腹主动脉放在冻存管内液氮骤冷保存。 1.3 观察指标 1.3.1 主动脉组织病理学观察 处死随机5只小鼠，每只小鼠主动脉根部取出4个相同切面，生理盐水冲洗，10%甲醛中兴溶液固定，石蜡包埋，。HE染色，普通光镜下观察组织及斑块的形态结构；Masson染色，光镜下观察斑块中纤维成分的分布。 1.3.2 免疫组化检测 采用SP法，加入一抗，二抗，DAB显色苏木精复染后，计数浸润于内膜的单核细胞数。以染色系数统计ＬＣ３的免疫组化染色结果。 1.3.3 实时定量RT-PCR操作 提取总RNA，经过反转录酶和随机引物等反应物混合配合成20μl体系后，反转录成cDNA，最后进行荧光定量PCR反应，对小鼠casepase-3mRNA的表达进行测定。 1.3.4 琼脂糖凝胶电泳 制作琼脂糖凝胶，制备胶版。点样板或薄膜上混合DNA样品和上样缓冲液，加样后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA的迁移速度与电压成正比，电泳完毕，取出凝胶。在波长为254nm的紫外灯下观察，于凝胶成像系统中拍照并保存。 1.4 数据统计方法 计量资料数据以均数±标准差（±s）表示。使用SPSS15.0数据处理软件进行统计学分析。多组均数比较用单因素方差分析。P0.05有统计学意义，P0.01有显著统计学意义，P﹥0.05无统计学意义。 2 结果 2.1 ApoE (-/-)小鼠腹主动脉组织HE染色在光镜下观察结果 空白对照组：动脉内膜附有一层内皮细胞，内皮细胞层呈现皱褶状排列均匀，表面光滑，未见泡沫细胞及炎