低温生物医学技术-第三讲.pptVIP

Mackenzie（1970）将酵母细胞快速冷冻至-196℃，然后分批慢速复温至不同温度，再快速复温，分别测定细胞存活率。 Bank(1970)将酵母细胞快速冷冻至-196℃，然后分批慢速复温至不同温度，再快速冷冻至-100℃ ，分别进行低温电镜观察再结晶情况。 结论：快速冷却过程中产生的胞内冰本身对细胞并非致命的损伤，但若在复温过程中速率过慢，使胞内冰再结晶，则对细胞的损伤是致命的；如果采取快速复温仍可能使细胞有教高存活率。复温速率越快越好吗？ 有关反玻璃化动力学理论查看相应的参考文献！如有兴趣，我们可以再补充！ The end 2.7 冻结过程中的未冻水份额 当水溶液或生物样品被冷却至其初始冻结温度后，就不断有冰晶形成和生长。由于冰晶中成分几乎全是纯水，从而提高了未冻基质（unfrozen matrix,UFM）浓度，这种浓度的升高会严重影响生物样品中细胞进行低温冻存时的存活率。 获得未冻水的方法 对于生物样品中未冻水份额一般采用估算方法（利用稀溶液冰点降低性质）； 也有采用一般扫描DSC方法测定（存在热事件滞后）； 华泽钊采用低温显微图象分析法（与图像识别精度有关）； 胥义采用分布扫描DSC方法测定。 低温生物医学技术第三讲 低温生物医学基本原理之二------ 玻璃化理论及其应用 3.1关于“两步法”低温保存机理的探讨 胞外出现冰（胞外冰）； 胞外溶液浓度增加； 胞内水分及时向外渗透; 细胞激烈收缩； 胞内不出现冰（无胞内冰）。 冻结以前: 慢速冷却过程: （细胞小、膜渗透率高、降温慢） 胞外溶液 胞内溶液 等渗 不等渗 胞外出现冰（胞外冰）； 胞外溶液浓度增加； 胞内水分来不及向外渗透; 胞内溶液过冷; 胞内出现冰（胞内冰）。 冻结以前: 快速冷却过程: （细胞大、膜渗透率低、降温快） 胞外溶液 胞内溶液 等渗 细胞低温损伤的两因素假说 存活率 冷却速率 (Mazur,1972) 胞内冰损伤 溶液损伤 总效果 胞外出现少量冰； 胞外溶液浓度略微增加； 不至于胞内水分向外渗透; 胞内溶液过冷,但胞内不出现冰。 冻结以前: 玻璃化转变过程: 胞外溶液 胞内溶液 等渗 有比较完美的保存方案吗？ WHAT “两步法”是指将置有细胞的含抗冻剂的盐水溶液，第一步是先慢速冷却至中间的某一温度；第二步是将其直接置入液氮。 WHY 第一步慢速降温，细胞周围形成高浓度溶液，只要未冻水份额不很低，在短时间内不会造成明显的损伤； 第二步直接投入液氮环境，容易形成非晶态，而不会造成或减少细胞损伤。 HOW 80年代，Mazur提出：造成过慢冷却过程中细胞损伤的主要机理并不是溶液中盐浓度过高，而是溶液中未冻水份额过低所致。但Pegg不认同此观点，至今未统一。 华泽钊（1987年）等用低温显微系统观察三元溶液DMSO-NaCl-水体系中白细胞存活率，证实了Mazur的假说。 当u低于0.13时，不论盐浓度是多少，白细胞存活率一般不超过30%；当u由0.13增高到0.2时，存活率急剧增高到80%以上。 3.2 玻璃化保存方法的发展 Luyet(1937)最早提出对生物体快速冷却,冰晶有可能来不及形成,就可以实现玻璃化保存。事实上，当时这种方法在对生物体进行低温保存的研究结果都是否定的（事实上都没有实现真正的玻璃化）。因此，此后一段时间的研究暂停！ Polge(1949)一次偶然发现，添加了甘油的家畜精子可以在低温下存活。 此后的20-30年间，大部分研究重点在低温保护剂对冰晶形成的影响，曾经几次观察到，如果低温保护剂浓度足够高，也可能在低冷却速率下也可实现完全的玻璃化，但遗憾的是：当时没有人进一步应用这一观察去试图实现生物体的玻璃化保存。 直到80年代左右，James，Ham(1981)的研究证实：采用低温保护剂后，快速冷却能够大大提高生物体的存活率。 Fahy(1981)首先明确提出：采用高浓度的低温保护剂，可在较慢的冷却速率下实现生物体完全的玻璃化，并于1985在Nature上首次报道鼠胚胎的玻璃化保存获得成功。这是玻璃化保存技术走向实用化的真正突破。 3.3 玻璃化转变的概念 自然界中，固体有两种形式：晶体和玻璃体。具有确定的体积和形状，并对改变体积和形状有阻力，两者根本区别在于内部的微观结构是否有序排列。 1、玻璃态物质的X射线衍射曲线与液态曲线相似，二者同属“近程有序，远程无序”的结构； 2、但玻璃态固体不会象液体那样流动，而象晶体那样能够保持自己的形态。 不同态物质中质点相互作用示意图 （a）气体；（b）液体；（c）晶体 3.3.1 液体可以通过两种方式而固化 1、当降温速率比较低时，在凝固点（熔点）Tm处，液体向晶体的转变，可表现为晶体固态的体积突然收缩（本人曾经在研究兔血管材料时，是先膨胀后减小的？？）； 2、