J第七章分子荧光法综述.ppt

一、 荧光分析的基本原理 二、荧光分析仪 三、分子荧光分析法及其应用 green-fluorescent protein (GFP) 3.激发态→基态的能量传递途径 3.激发态→基态的能量传递途径 激发光谱和发射光谱 荧光光谱的形状与激发波长无关。 原因！ 3. 荧光光谱的特征 一、 荧光分析的基本原理 二、荧光分析仪 三、分子荧光分析法及其应用 激发态→基态的能量传递途径 激发光谱和发射光谱 3. 荧光光谱的特征 产生荧光的物质: 芳香族化合物 含脂肪族和指环族羰基结构的化合物 稠环化合物 苯环被稠化至杂环核上的杂环化合物 1. 荧光猝灭 溶液荧光猝灭的主要原因 激发光源(light source) 样品池(吸收池)(absorption cell) 单色器(monochromator ) 检测器(detecor) 记录及数据处理器(display) 紫外-可见分光光度计测量池(吸收池) 滤光片、棱镜、光栅 光电池或光电倍增管, 光电二极管阵列式检测器 问题：荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计有何异同点？ 荧光分光光度计与紫外分光光度计的区别 7-4 荧光分析法的应用 3. 荧光分析注意事项 1） 防止荧光污染 2） 防止散射光的干扰 三、荧光分析法的应用 三、荧光分析法的应用 2. 有机物分析 芳香族化合物、胺类、甾族化合物、蛋白质、酶与辅酶、维生素、多种药物等 可提高测定的灵敏度和选择性 荧光法测定抗坏血酸 总结： 1. 分子荧光分析法的基本原理（理解） 2. 激发光谱和荧光光谱（掌握） 3. 荧光光谱的特征（掌握） 4. 荧光量子产率（掌握） 5. 荧光强度与浓度的关系（理解） 6. 荧光与分子结构的关系（理解） 7. 荧光猝灭（掌握） 8. 温度、酸度、溶剂对荧光强度的影响（理解） 9. 荧光分光光度计的结构特点（掌握） 10. 荧光分析法中直接法和间接法的概念（掌握） 1.直接测定和间接测定直接测定：被测物质本身发生荧光 间接测定：被测物质本身不发荧光或荧光量子产率很低。 ①衍生化法；②荧光猝灭法 1.无机物分析：采用间接法 （1）与有机试剂形成配合物后测量 Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、Gd、Ge、Hf、Mg、Nb、Rh、Ru、S、Sb、Se、Si、Sn、Ta、Tb、Th、Te、W、Zn、Zr （2）通过其对荧光试剂的荧光增强或猝灭效应进行测定。 CN-、F-与Al、Zr离子强烈配合→使原有荧光配合物的荧光猝灭。 目前可测量元素已有约60多种。 尿液中维生素B2的测定 维生素B2（核黄素）430 - 440 nm蓝光照射下产生绿色荧光。 Λem：535 nm。（pH 6-7，荧光强度最大，pH 11，荧光消失） 3、生物、医学研究 内源荧光与外源探针 蛋白荧光 膜探针 核酸探针 GFP是一种在395nm的激发光下可以释放出绿色荧光的蛋白，现已广泛的应用于生物以及医学研究。该蛋白可以表达在真核细胞中，在和其他基因融合表达的情况下，可以活体示踪目的蛋白的定位以及活动. 通过跟踪发出的绿光来观察病毒在宿主体内的扩散途径；或者把GFP接合到一种蛋白质上并通过显微镜观察它在细胞内部的移动 从水晶水母体内第一次分离出荧光基因 日裔科学家下村修1962年首先在水母中发现GFP Martin Chalfie(沙尔菲)指出GFP的发光特性在生物示踪方面有极高价值； ???? n??? 振动弛豫 激发 ??? ? ?? ? n 荧光 （1）跃迁类型 ????跃迁是产生荧光的主要跃迁类型 较大的摩尔吸光系数 较短的激发态寿命10-7~10-9s 系间窜越至三重态几率小 （2） 共轭效应 共轭体系越大、共轭程度越高，荧光越强。 0.07 0.18 0.93 0.27 化合物 苯 萘 蒽 丁 省 戊 省 580 390 365 286 205 λexmax(nm) 640 480 400 321 278 λemmax (nm) 0.52 0.60 0.46 0.29 0.11 ?F 1）给电子取代剂加强荧光 （3）取代基效应 —HN2， — NHR ， —NR2， — OH， — OR ， — CN 产生 p →π共轭 二苯甲酮：弱荧光、强磷光 S1 →T1的系间窜跃产率接近1 苯甲醚 苯基氰 苯胺 苯酚 苯 化合物 285~345 280~390 310~405 285~365 278~310 λ emmax (nm) 20 20 20 18 10 相对荧光强度 2）吸电子取代基减弱荧光、加强磷光 —C=0， —