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第三章 细胞生物学研究方法 显微技术 生物化学与分子生物学技术 细胞培养 一、显微观察中的几个参数 放大倍数：成像大小与原物体大小比值。 分辨率（分辨力）：指分辨物体最小间隔的能力。 样品的反差情况：被观察结构与其背景对光吸收的差别程度。 光的干涉 分辨率——取决于光源波长λ、物镜镜口角α和介质折射率N 二、光学显微镜： 以可见光（或紫外线）为光源。 样品制备 固定 样品保持在原始状态。 包埋 石蜡或树脂包埋 切片 制成薄片 染色 提高对比度。 2. 活细胞观察 相差显微镜（P. Zernike，1932） ： 物镜后装有相差板，根据细胞内容物的折射率不同来增加样品反差。 微分干涉显微镜(1952,nomarski）：平面偏振光，增加样品反差。 将直射光和物体衍射的光分开； 使两束光相互干涉，使物体呈现明暗对比，因而能够辨认无色透明物体。 3 荧光显微镜 (1941,Coons） fluorescence microscope 光源和样品之间加上激发滤光片。 物镜和目镜之间装有阻断滤片。 免疫荧光染色及荧光放大技术 用于特异蛋白在细胞中的定位研究； 根据抗原抗体的特异性结合特性。 多荧光染色技术 4 激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope 用激光作光源； 能显示细胞样品的立体结构。 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 5 倒置显微镜 三、电子显微镜以电子束为光源。用于观察超微结构（小于0.2μm），又称亚显微结构。 1 扫描电子显微镜 scanning electron microscope, SEM 1. 原理 光学显微镜照片×1000 第二节 生物化学与分子生物学技术 1 差速离心 Differential centrifugation 根据被分离物质的体积差异，采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。 介质密度均一； 速度由低向高，逐级离心； 体积越小，需要离心速度越高， 。 2 密度离心 速度沉降 分离密度相近而大小形状不同的细胞组分； 密度梯度较小； 各细胞组分在不同速度下沉降，形成不同沉降带。 等密度沉降 分离不同密度的细胞组分； 介质为高密度连续梯度； 组分在相同离心力下长时间沉降到与自身密度相等的位置。 二、分子杂交技术 分子杂交（molecular hybridization） 指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则杂交，形成异质双链的过程。  2 Southern杂交 3 菌落杂交 第三节 细胞培养 一、动物细胞培养 原代细胞 （primary culture）从有机体取出后立即培养的细胞 ，通常指1～10代体外培养细胞。 传代细胞（subculture）适应在体外培养传代的细胞。 细胞系（cell line）：可传代40～50次的传代细胞。 连续细胞系：原代培养细胞成功传代即为细胞系,可能无限制的传下去。 动物细胞培养过程 植物细胞培养 三、细胞融合 融合方式：病毒介导，化学物质介导（PEG等),电融合等 单克隆抗体1975，Milstein Kohler Low speed High speed Differential centrifugation 在离心管内形成一密度梯度，通过离心力作用使不同密度的颗粒悬浮到相应的介质密度区。 常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。 Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation 层析法-分离蛋白质等生物大分子物质，根据待分离组分的形态、大小、电荷的不同进行分离方法。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离蛋白质和DNA等； 根据样品大小、形状、电荷分布不同所引起在电场中迁移速率不同达到分开的目的。 The Fluorescent Activated Cell Sorter 人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片 1 原位杂交（in situ hybridization） 可获得大量的细胞； 在离体条件下观察和研究细胞生命活动的规律，包括细胞的运动、信号转到，合成代谢等 群体培养（左）和克隆培养（右） 二、植物细胞培养 外植体培养：诱发产生愈伤组织。 原生质体培养：培养脱壁后的细胞。 单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。 通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交。 * 不同光线的波长 Magnification and resolution 细胞大小和观察 人眼 0.2 mm； 光镜 0.2