4 第四讲 常用分子克隆工具酶简介.pptVIP

1 DNA Ligase 1.1 概念 1.2 分类 根据连接反应时所需能量辅助因子的不同： 依赖ATP的DNA ligase 依赖NAD+的DNA ligase 按照来源分： T4噬菌体DNA ligase 大肠杆菌DNA ligase 热稳定DNA ligase 3 DNA ligase 催化连接反应的特点 3.1 需要3-OH 和5-P 3.2 需要ATP或NAD+和Mg2+为辅助因子和激活因子 3.3 被连接的是dsDNA 3.4 只能封闭缺口 4 影响DNA ligase 连接反应的因素 4.1 温度 黏性末端 4-15℃ 平末端 10-20℃ 4.2 连接酶浓度 平末端 1-2个单位 黏性末端 0.1个单位 4.3 ATP浓度 4.4 DNA片段末端 第二节 DNA 聚合酶和反转录酶 DNA 聚合酶：在引物和模板的存在下，把脱氧核糖单核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3′-OH 末端，催化核苷酸的聚合作用。 DNA pol I特性： ⑴ 5‘-3’DNA聚合酶活性 ⑵ 3‘-5’外切酶活性 ⑶ 5‘-3’外切酶活性 （切口平移） 用途： ⑴补平反应 ⑵末端标记 ⑶抹平反应 第三节 DNA修饰酶 第四节 外切核酸酶 1 外切核酸酶概念 2 分类 按照酶对底物二级结构的专一性，分为： 作用于单链的外切核酸酶 作用于双链的外切核酸酶 第五节 单链内切核酸酶 1.2 Bal 31 核酸酶 对单链DNA具有特异的内切酶活性，可从3‘OH端降解DNA。对于L-DNA，它表现3’-5‘的外切酶活性和5’-3‘的外切酶活性，可又有控制地从3’端和5‘端逐个水解除去单核苷酸，产生缩短了的DNA分子。 第六节 RNA酶 1.1 RNase 用途： ⑴ 在DNA制备时用于降解RNA分子 ⑵ 去除DNA:RNA 或RNA:RNA中没有杂合的 RNA区域 1.2 RNase H 特异地降解DNA:RNA杂合链中的RNA部分，产生不同长度的具有3’OH和5‘P端的寡核苷酸，它不能降解单链或双链的DNA（或RNA). 思考题： 常见工具酶的特点 1.1 S1核酸酶 特点： ss-DNA; ss-RNA; 双螺旋变性区 用途 1) 基因突变--缺失，常与外切酶，如ExoIII、λ外切酶、Bal31连用 2) DNA定序分析 3) S1作图法 4) 基因结构分析 5) tRNA结构分析 ExoIII S1 S1 S1 S1 S1 S1 Poly(A) Poly(A) 5 5 5 5 5 5 S1核酸酶活性 1.3 DNase I 用途 1) 切口移位，制备DNA探针 2) 制备RNA样品时除去DNA分子 3) 基因突变时产生切口 ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口 裂口(gap) 缺口(nick) 断口(cut) 3HO P5 3HO P5 Mn++存在时 Mg++存在时 DNaseI 作用特点 DNaseI HO P 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ DNaseI与 Pol I 的 切口移位 Pol I * * 常用工具酶简介 第一节 DNA连接酶(DNA ligase) 2 DNA ligase简介 2.1 T4 DNA ligase 连接类型： DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA dsDNA的黏性末端和平末端 2.2 大肠杆菌 DNA ligase