第3章 沉淀技术.pptVIP

Enter presentation date 第三章 沉淀技术 Test 第一节 概述 3.1.3 沉淀技术的应用特点 盐析法—蛋白质在水溶液中的溶解度受盐浓度影响 蛋白质溶解：相似者相溶 亲水性和疏水性： 有利因素：亲水性，包括氢键、极性基团、离子化侧链、亲水蛋白所占的%等。如白蛋白 不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基团、疏水蛋白所占的%等。如纤维蛋白原。 小结 原理 1.高浓度盐离子使蛋白质表面双电层厚度降低，静电排斥作用减弱. 2.中性盐比蛋白质具更强的亲水性，因此将与蛋白质争夺水分子. 2、盐析公式及讨论 蛋白质溶解度与溶液中离子强度关系： lgS =β-ksI S，蛋白质溶解度（g/L） I 0.5MK2SO4的离子强度I＝(0.5 × 2 × 12+0.5 × 22)/2=1.5。 1MNaCl的离子强度?＝(1 × 12+1 × 12)/2=1 β为常数，I=0时的lgS ks为盐析常数，与盐性质（离子价数、离子半径等）、蛋白结构有关，ks越大，盐析效果越好（S越小，越易沉淀） 3.3.2 盐析的影响因素 蛋白质的种类 蛋白质的种类不同，Ks值会有所不同； 分子量越大，沉淀所需盐的量越少； 蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀。 无机盐种类 阴离子盐析作用顺序 柠檬酸盐PO43－SO42－CH3COO－Cl－NO3－SCN－ 阳离子盐析作用顺序（一价） NH4+K+Na＋ 3.3.3 沉淀的再溶解 3.3.4 脱盐 实例 调节两性生化物质溶液的pH值，以达到某一生化物质的等电点，使其从溶液中沉淀析出而实现分离的技术称为等电点沉析技术。 等电点(pI)是两性物质在其质点的净电荷为零时介质的pH值,溶质净电荷为零，分子间排斥电位降低，吸引力增大，能相互聚集起来，沉淀析出，此时溶质的溶解度最低 特点 等电点沉淀法操作十分简单，试剂消耗少，给体系引入的外来物也少，是一种有效的蛋白质初级分离方法，尤其对疏水性较强的蛋白质。其主要优点在于很多蛋白质的等电点都在偏酸性范围内，而无机酸通常价格低廉，因此可以省去除酸的步骤。 3、实例 二、选择性变性沉淀法 实例 CTAB(十六烷基三甲基季铵盐溴化物) 与多糖上的阴离子形成形成季铵络合物，降低离子强度，络合物析出。 酚、氯仿、十二烷基磺酸钠等 目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀，核酸则存在于水溶液中。 第三节 沉淀技术的应用 3.3.1 蛋白质 棉铃虫谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）的纯化 聚乙烯亚胺（PEI）+硫酸铵+PEG+亲和层析，棉铃虫幼虫中的GST PEG10000PEG20000(NH4)2SO4 ? 多种沉淀技术的结合使用 β-甘露聚糖酶（β-mannanase） 枯草芽孢杆菌发酵 丙酮沉淀/(NH4)2SO4/PEG 比较后丙酮最佳 ? 不同沉淀技术的比较 3.3.2 核酸 3.3.3 多糖 Any chromatography separation will be a compromise between speed, capacity, resolution and recovery. The next few slides show the shift in focus with respect to these parameters, during a purification procedure. For a good description of this and the next two slides: see Ion Exchange Chromatography - Principles and Methods, code no 18-1114-21 ed. AA, p. 109 - 112. Normalemnte los procesos de purificación empiezan con grandes volumenes procedentes de extractos crudos o cultivos cellulares. Rapidez: Para reducir al máximo el tiempo de aplicación de la muestra y evitar proteolisis u otros efectos destructivos Capacidad: Escoger un gel de alta capacidad nos permitira reducir al máximo la “escala” de equipamiento que nece