第三章 大肠杆菌基因工程-3.ppt

表达产物的后处理路线： S S S S C N 胰蛋白酶 C peptide A peptide B peptide M R R K R CNBr R S S S S C N N C S S S S R 羧肽酶B B链中第22位上的Arg和第29 位上的Lys由于良好折叠的原 因，对胰蛋白酶不敏感 人胰岛素原（BCA）表达法 A链和B链同时表达法 tac b-Gal ori Apr Met Met M M N C B peptide A peptide 化学合成AB链编码序列 重组人胰岛素 转化 分离纯化 CNBr 处理 特异性裂解 体外折叠 1、试述大肠杆菌表达系统工程菌构建技术路线及工程菌鉴定内容。2、工程菌质粒不稳定性的表现形式和机制是什么？有哪些改进策略？ 3、如何进行工程菌遗传稳定性分析？分析项目包括哪些？什么是质粒的宏观逃逸率？如何测定？ 4、工程菌常规保存条件为何？菌种库包括哪几种形式？相互关系如何？5、影响工程菌发酵的主要因素有哪些？什么是工程菌的生长曲线和表达曲线？最佳诱导时机在工程菌生长曲线中的什么时期？ 6、工程菌工业发酵工艺流程如何？发酵工艺研究需要解决的主要问题是什么？如何实现大肠杆菌高密度发酵？ 7、表达产物分离纯化研究的主要内容和原则是什么？? 8、大肠杆菌系统表达产物粗提工艺包括哪些内容？ 9、表达产物精纯的主要任务是什么？为什么主要采用色谱柱分离（层析）技术？在分离纯化三步策略中各有哪些层析技术可选择？ 思考题（工程菌构建、发酵、分离纯化） 题目： 重组人白介素-2（rhIL- 2 ）大肠杆菌工程菌的构建 请你根据所学习知识，从基因克隆开始，为rhIL- 2构建大肠杆菌工程菌株，进行工程菌稳定性和表达分析，并根据你的工程菌构建策略提出相应的发酵与分离纯化策略。 作业：在5月25日前交， 严禁互相抄袭！ 题目： rhIL- 2大肠杆菌工程菌的构建 摘要：本文研究目的、内容与结果（200字以内） 前言：简要介绍rhIL- 2的理化特性、基因结构、生物学活性 、临床潜在用途、本文研究目的（500字以内）。 材料与方法： 1）菌株、质粒、培养基名称与来源（可虚拟） 2）工具酶、关键试剂名称与来源（可虚拟） 3）仪器：关键仪器名称与来源（可虚拟） 4）方法：基因克隆和表达载体构建的全过程、质粒与工程菌鉴定、遗传稳定性分析、工程菌培养与表达诱导分析等的具体方法名称与基本操作过程。 4、结果与讨论 1） rhIL- 2基因克隆 须包含基因编码序列、PCR或RT-PCR的引物序列、供克隆操作的酶切位点等信息。PCR产物电泳结果请绘图。 2）表达载体与工程菌构建 工具质粒和宿主菌允许虚构，但须注明关键元件、目的基因克隆位点、构建所获表达载体的物理图谱（示意图）、表达调控方式、酶切鉴定方法。请尽量采用流程图形式说明构建过程。 3）工程菌生长与表达分析 须包含工程菌生长曲线、表达产物初步鉴定（SDS、Westernblot）、表达曲线等。 4）工程菌传代稳定性分析 须包含结构稳定性和分配稳定性分析结果 5）发酵和分离纯化策略 必须根据你的工程菌构建策略描绘可能的发酵与分离纯化工艺设计策略，并给出相应的工艺流程图。 工程菌生长曲线与表达曲线分析 生长曲线 纵坐标：生物量（细胞密度OD600、干重/体积、湿重/体积） 横坐标：培养时间（小时） 时期：停滞期、加速期、对数期、减速期、平台期、衰减期 表达曲线 纵坐标：表达水平（%）、活性单位/体积 横坐标：培养时间（小时） 1、培养基 影响菌体生长、质粒稳定性、表达水平、产物可溶性等 碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等 应避免外源基因表达的“葡萄糖效应”。 氮源： 有机氮：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆 无机氮： 氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等 其他：无机盐、微量元素维生素、生物素等 工程菌生长与表达主要影响因素 2、菌龄与接种量 菌龄：自接种起培养的时间（小时） 影响停滞期、质粒宏观逃逸率 接种量：是指接入的种子液体积占培养液体积的百分比 接种量过小：延长菌体停滞期，质粒宏观逃逸率高 接种量过大：菌体生长过快，代谢产物积累过多，抑制后 期菌体的生长，降低表达水平。 3、pH值、温度与溶解氧 pH值：影响生长速度、表达水平和产物可溶性。 生长最适pH范围在6.8-7.4，表达最适pH为6.0-6.5 温度：影