糖苷酶基因工程及应用.docVIP

糖苷酶基因工程及应用 糖苷酶即糖苷水解酶(Glycoside hydrolases, GH,EC3.2.1) ,是一类水解糖苷键(glycosidic bonds)的酶,在生物体糖和糖缀合物的水解与合成过程中扮演着重要角色。糖苷酶在催化糖苷反应时,如果水分子的氧原子进攻受体葡萄糖上的异头碳,即发生水解反应,但如果是葡萄糖羟基上的氧原子进攻受体葡萄糖上的异头碳,即发生转糖基反应。对其性质和功能的研究一直是生物学和糖生物学关注的热点。目前已知的糖苷酶大约有2 500 多种,根据序列相似性分为100 多个家族,每一个家族的酶具有相同的空间结构和反应机制。 糖苷酶根据催化作用机制的不同分为两类: 构型翻转酶和构型保持酶,其中,构型保持酶在催化糖苷键水解的同时,还具有转糖基活性,即糖苷键合成活性,该性质使其成为糖类合成的重要工具。近年来,随着对该类化合物的深入研究,许多糖基化合物需要经改性后才能满足人们的要求,而糖苷酶在这一任务中无疑将扮演重要角色,利用糖苷酶对糖基化合物的糖基定向改造工程成为一个研究热点。 目前有几种常见的糖苷酶：α-甘露糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、β-木糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-呋喃果糖苷酶、壳三糖苷酶、耐高温β-甘露糖苷酶以及硫代糖苷酶等。这些酶在生物体内和体外都具有重要的作用。所以研究糖苷酶具有重要的意义。 1.糖苷酶基因工程 糖苷酶可以通过微生物发酵法和提取法得到。发酵法生产的糖苷酶的微生物主要有黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、节杆菌(Arthrobacter sp.)。 但是，自然界现有的糖苷酶普遍存在着含量少、产酶活力低、产物提取分离与纯化困难、稳定性差、底物特异不高、催化能力低等问题, 从而使得糖苷酶的生产成本高、产量低，远不能满足需求,需要对其进行改造使之更加符合人们的要求。近年来,随着基因工程、酶工程等现代生物技术的迅猛发展,酶分子的改造取得了辉煌成就,这也成为糖苷酶改造的有力工具。如可以通过基因工程和微生物工程技术,构建基因工程菌,进行高密度培养,以获得大量的糖苷酶源;还可通过定点突变、体外分子定向进化等方式对天然糖苷酶分子进行定向改造和进化。值得一提的是,酶分子的体外定向进化技术是改造糖苷酶的一种行之有效的新策略,模拟自然进化进程,通过易错PCR等技术对编码糖苷酶的基因进行随机突变,再由DNA重组、交错延伸过程、随机引导重组、递增截短技术等进行突变基因的体外重组,使基因发生大量变异,并定向选择出所需性质或功能的糖苷酶,从而使几百万年的自然进化过程在短期内得以实现。 1.1 重组糖苷酶基因的表达 以耐热β-半乳糖苷酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆和表达来具体的阐述。 通过基因工程进行糖苷酶的重组表达的步骤： RNA或总DNA的提取； 以嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus stearothermophilis ATCC8005 作为高温乳糖酶基因的供体菌，从中提取基因组DNA。 ②引物设计； pZZ01质粒启动子之后有Kpn Ι酶切位点，但是此位点后还含有枯草杆菌翻译所需的SD序列，所以上游引物合成时需要带上这段SD序列。上游引物为：5’-ACCGGTACCCAATTCGGAGGTGGAAATGTAATTATGAATGTGTTATCCTC-3’(下划线KpnΙ位点，放抗内为SD位点)；下游引物为5’-TATGGATCCCTAAACCTTCCCGGCTTC-3’(下划线BamH Ι位点)。 ③目的片段的扩增及验证； PCR扩增条件首先为94℃读变性，其次是94℃变性50s，54℃退火50s，72℃延伸4min，循环30次，第三是72℃延伸10min。 ④重组表达质粒的构建何鉴定； 以大肠杆菌TGI(supE hsdΔ5thiΔ (lac-proAB)F[traD36proAB+ lacIq lacZΔ M15])用来作为大肠杆菌克隆宿主； 枯草芽孢杆菌WB600 (hisΔ nprBΔ nprE18Δ aprEΔ eprΔ bpfΔ mpr) 作为表达宿主。以大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pZZ01作为载体。质粒构建的流程见下图。 按上述PCR方法，扩增得到2Kb左右的片断，胶回收PCR 产物，直接KpnΙ、BamHΙ双酶切，纯化酶切产物，同时质粒pZZ01KpnΙ、BamHΙ双酶切，胶回收6.7kb的片断，这2个片断用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，挑转化子提质粒进行双酶切和PCR鉴定，双酶切鉴定如图 ⑥目的蛋白的诱导表达； 在大肠杆菌表达载体中需要IPTG诱导β-半乳糖苷酶的表达，而IPTG比较昂贵。但是在次表达系统中采用的是组成型质粒，所以不需要诱导。 ⑦表达产物的鉴定与活性检测。 收