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一种能选择性分离食物中苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的免疫亲和色谱分析方法Yuan Li a, Yuzhen Wang a, Hong Yang b,c, Yan Gao a, Huihui Zhao a, Anping Deng a,d,?a四川大学药学院，成都610064，中国b四川大学华西药学院，成都610041，中国c苏州大学药学院，苏州215123，中国d苏州大学化学、化学工程和材料科学学院，苏州215123，中国[摘 要]：本文描述了一种能选择性分离食品中常见非法色素添加剂苏丹红(苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)的免疫亲和色谱方法(IAC)。IAC柱主要由经共价耦联在溴化氰活化琼脂糖凝胶(4B)?上的苏丹Ⅰ单克隆抗体和装有常见固相萃取物的柱子组成。检测发现，IAC柱对苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ最大吸附浓度分别为259，156，184和173ng。IAC的整个提取分离过程包括：加样、洗涤及洗脱方案优化。通过过程的优化，IAC柱的提取物回收率在95.3~106.9%这两个浓度间波动。经过50次重复使用后，IAC柱的吸附能力还保持在最大吸附能力的64%。从市场上随机选取6种食品样品通过IAC检测与HPLC检测都未发现苏丹红添加剂。经检测发现，6种样品中都不含苏丹红Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，但其中三个样品检测到含2.7~134.5 ng.g?1的苏丹Ⅰ添加剂。为了进一步验证提取率，在三个阴性样品中添加浓度为20 ng.g?1到50 ng.g?1的苏丹红Ⅰ~Ⅳ标准品，再经IAC柱提取分离，得到单个化合物的回收率在68.6~96.0%之间，RSD值在4.8~15.2%之间，证明了采用IAC方法分离苏丹红染色剂具有可行性。关键词：亲和色谱免疫方法；苏丹红；食品样品；HPLC概述苏丹红染色剂包括苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，它属于工业上的偶氮染料化合物，传统上主要用于制备蜡、油墨、塑料和油及用于抛光等。最近，在从欧洲和其他几个国家进口的食品中检测发现了这些添加剂的存在。因为苏丹红颜色鲜红，看起来像天然产品的颜色而被添加到食品当中，如辣椒粉和酱油等。苏丹红是公认的潜在致癌物质，因此，任何掺杂有苏丹红添加剂的食品都会危害人类的身体健康。因苏丹红对人身健康的相关危害，FDA和EU将苏丹红归为非法食品添加剂，IACA也将苏丹红定义为3级致癌物质，由此可知，世界上任何一个国家或国际食品监督管理法案都不允许使用这些食品颜色添加剂。苏丹红的标准分析方法的基础是由EU建立的液相色谱分析方法。其他与液相分析方法相关的如通过使用不同的检测器，具体包括UV、APCI-MS、ESI-MS、DAD、DAD-ESI-MS、ESI-MS/MS、Q-TOF-MS、CL及电化学检测等，这些检测食品样品中苏丹红含量的方法都有相关的研究报导。一般而言，色谱分析方法具有较好的准确性及灵敏度，但是其价格昂贵且需要的时间较久，尤其是其操作过程复杂、实验仪器昂贵且样品准备过程复杂等，限制了其使用范围。考虑到食品样品中含有非常复杂的化学成分及浓度非常低的苏丹红添加剂，所以针对样品的制备过程中需要对样品化学成分进行提取与富集后再分析检测。常规的苏丹红分析样品的制备方法是固液萃取方法。这项技术需要大量的有机溶剂，并且费时还有一定的潜在毒性。其他有报导的苏丹红分析的样品制备技术有超声辅助提取法及离心沉淀法。近些年来，中性氧化铝固相萃取(SPF)柱被用于食品样本分析前的净化制备。虽然这些步骤的操作过程简单且廉价，但是它需要长时间的提取过程以及在洗脱过程中需使用大量的有机溶剂。另外，活化的中性氧化铝对于目标分析物的回收率具有巨大的影响。因此，开发简单、快速和高效的样品制备技术对于分析食品中是否含有苏丹添加剂具有重要意义。酶联免疫亲和色谱是一种利用抗原、抗体之间相互作用的单一性和可逆性原理的分离提取方法。固定在固定相上的抗体能识别目标分析物(抗原)，固定抗原能够特异性捕获流经固定相上的抗原。被固定的抗原能够被洗脱下来，且固定相也能重新使用。IAC是一种独特且有效的能够一步筛选并富集一种或一类样品的分析技术。大多数的IAC方法主要是用于专门捕捉一种化合物，近年来，发展多元分析IAC在不同基质中的几种化合物分离提取方法获得了更多的关注。多元分析IAC发通常是将两种或三种单克隆抗体或一种多克隆抗体固定在固定相上进行使用。在前面研究中，我们成功的合成了抗苏丹Ⅰ的单克隆抗体，并且建立了检测苏丹Ⅰ的相应的酶联免疫分析(ELISA)方法。通过利用我们制备得的大量单克隆抗体检验苏丹Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的交叉反应率，目的是为了确定IAC柱选择性分离提取与富集食品中苏丹红Ⅰ~Ⅳ法优于HPLC分析法。纯净的单克隆抗体通过共价耦联在溴化氰活化琼脂糖凝胶(4B)?上，再将其装载在SPF柱上。苏丹红Ⅰ~Ⅳ的酶联免疫柱分离提取条件优化和免疫柱的特征吸附主要是为了提取物的回收率