第5章+细胞培养++讲义.docVIP

第五章 细胞培养 由完整的植物器官分离单细胞 叶组织是分离单细胞的最好材料。BallJoshi和Noggle曾先后由花生成熟叶片得到了离体细胞。他们(成分见表62)中培养。在培养中很多游的大多数其他植物的叶片中分离出活细胞。 现在广泛用于分离叶肉细胞的方法是先把叶片轻轻研碎，然后再通过过滤和离心把细胞净化。做法是在研钵中放人10 g叶片和40 ml研磨介质(20mol蔗糖，10mol MgCl2，20mol tris-HCl缓冲液，pH值78)，用研杆轻轻研磨。之后，将匀浆用两层细纱布过滤，在研磨介质中以低速离心将得到的(其中可能包括禾本科植物，但尚未证明)也能通过这个方法产生完整的叶肉细胞。应用类似方法由马唐中分离出具有代谢活性的叶肉细胞和维管束鞘细胞，由菠菜中分离出叶肉细胞由篱天剑石刁柏叶片中分离大量游由大豆子叶分离出了活细胞 和酶解法相比，用机械法分离细胞至少有两个明显的优点：①细胞不受酶的伤害；②不会发生质壁分离。这点对生理和生化研究来说是很理想的。一般用机械法分离的细胞能够发生分裂并形成愈伤组织。但这种机械分离细胞的方法并不普遍适用，只有在薄壁 1.1.2酶解法 利用果胶酶(pectase)处理植物叶片，使细胞间的中胶层发生降解，分离出具有代谢活性的细胞。Takebe等(1968)最早报道了由烟草叶片通过果胶酶处理分离叶肉细胞的方法（p98～99，附录6.2）Takebe等(1968)证明，在离析混合液中0.3mol／L，烟草原生质体将会在细胞壁内崩解。由培养组织中分离单细胞 用于基础研究和应用研究的单细胞系统，在传统上常常是由离体培养的组(subculture)。通过反复地在琼脂培养基上继代，不但可使愈伤组织Wilson和Street(1975)观 由愈伤组织获得游离细胞的具体做法是，把未分化的和易散碎的愈伤组织2 g转移到装有30～50 m1液体培养基的三角瓶中，在25℃±1℃，弱光或黑(120 r／n)。初期每10 d左右用新鲜培养4／5的旧液，同时将飘浮在原培养液上层的细胞碎片和悬浮培养悬浮培养悬浮培养1在分批培养中每单位容积悬浮培养液内的细胞数与培养时间关系的示意图 (引自wilson等，1971)如果转入的细胞密度很2～3 d即继代一次，则可使悬一般讲，这些时间都长于在整体植株上分生组织中 在对悬浮培养细胞(2～4个细胞)，而不能通过大的细胞聚集 分批培养对于研究细胞的生长代谢并不是一种理想的培养方式。在分批培养中，由于细胞生长和代谢的方式以及培养基成分不断改变，没有一个稳定的生长期，相对于细胞的数目，代谢产物和酶的浓度也不能保持恒定。这些问题在某种程度上可通过连续培养加以解决。 2.2.2半连续培养 半连续培养是利用培养罐进行细胞大量培养的一种方式。在半连续培养中，当培养罐内细胞数目增殖到一定量后，倒出一半细胞悬浮液于另一个培养罐内，再分别加入新鲜培养基继续进行培养，如此这样频繁地进行再培养。半连续培养能够重复获得大量均匀一致的培养细胞供生化研究之用。 2.2.3连续培养 连续培养(continuous culture)是利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种方式。连续培养的特点是：在连续培养中由于不断注入新鲜培养基，排掉旧的培养基，保证养分的充足供应，不会出现悬浮培养物发生营养亏缺的现象。连续培养可在培养期间内使细胞长久地保持在对数生长期中，细胞增殖速度快。连续培养适于大规模工厂化生产。连续培养有封闭型和开放型之分。 (1)封闭型连续培养 封闭型连续培养是指在培养过程中，排出的旧培养基由加入的新鲜培养基进行补充，进出数量保持平衡，从而使培养系统中营养物质的含量总是超过细胞生长的需要。悬浮在排出液中的细胞经机械方法收集后再放回到培养系统中，因此在这种培养方式中，随培养时间延长，细胞密度会不断增加。 (2)开放型连续培养 在开放连续培养中，注入的新鲜培养液的容积与流出的培养液容积相等，其中细胞的密度也保持恒定，并通过调节流入和流出的速度，使培养细胞的生长速度一直保持在一个稳定状态，流出的细胞数相当于培养系统中新细胞的增加数。开放型培养又可分为两种主要方式：一是化学恒定式；二是浊度恒定式。 ①浊度恒定式。在浊度恒定培养中，新鲜培养基是间断注入的，受细胞密度增长所引起的培养液浑浊度增加的控制。可以选定一种细胞密度，当超过这个细胞密度时，使细胞随着培养液一起排出，以保持细胞密度的恒定。 ②化学恒定式。在化学恒定式培养中，为使细胞密度保持恒定状态，可采用两种方法。一种是以固定速度注入新鲜培养基，将培养基内的某种营养成分(如氮、磷或葡萄糖)的浓度调节成为一种生长限制浓度，从而使细胞的增殖保持稳定状态。在这种培养基中，除生长限制成分以外的其他成分的浓度都保持在细胞生长