基因工程 03 基因工程的载体.ppt

野生型λ-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型λ-DNA的长度，可以提高装载量。 野生型λ-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型λ-DNA的长度，可以提高装载量。 EMBL4:DNA may be inserted into any of the cloning sites; the choice depends on the method of preparation of the fragments. Often a partial Sau3A or MboI digest is used in the preparation of a genomic library (see Section 6.3.2), which enables insertion into the BamHI site. * ?M13 噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。These coliphages have been developed as cloning vectors, for they have a number of advantages over other vectors, including the other two classes of vector for E. coli, plasmids and phage λ. 噬菌体首先吸附大肠杆菌的雄性鞭毛上，然后穿过鞭毛内孔将DNA注入细菌体内。单链DNA利用宿主细胞复制另一条链（负链），形成双链DNA（RFDNA），然后以负链为模板，进行滚环式复制，当滚环复制的单链DNA拷贝数达到100-200时，负链上的基因产物干扰复制，使其停止，同时，由两条链上编码的蛋白基因表达，包装正链，并分泌至体外，宿主细胞不会发生裂解。细菌细胞每分裂一次，大约可以释放1000个新的病毒颗粒。 这些丝状噬菌体表现出一系列其它载体所不具备的优越性：　　第一，单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形DNA为中间媒介的。这种复制形式的DNA（replication form DNA，简称RFDNA）,可以如同质粒DNA一样，在体外进行纯化和操作。　　第二，不论是RF DNA还是ssDNA，它们都能够转染感受态的大肠杆菌寄主细胞，并依据所采用的实验方法而定，或产生出噬菌斑，或形成浸染的菌落。　　第三，单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA多寡制约的。因此对它们来说，并不存在包装限制的问题。　　第四，应用这类单链DNA噬菌体，可以容易地测定出外源DNA片段的插入取向。　　第五，可产生大量纯化的含外源DNA片段插入的单链DNA分子。这种重组体单链DNA分子可按双脱氧链终止法作核苷酸序列测定，也可用于制备具放射性同位素标记的DNA探针，还可进行寡核苷酸定点突变。 由于复制起始位点决定了质粒的宿主，在基因工程中就可以人为地针对某个特定的宿主制造某种质粒，只要这种质粒含有相应的复制起始位点，它就能在这个宿主中存在，而不必管这个质粒DNA上的其他结构。 外源基因进入宿主细胞会受到很多限制，如：外源DNA很难进入受体细胞（没有相应的转移体系）；外源DNA一般不带复制子系统（细胞增殖过程中就容易丢失）；外源DNA一般不具备表达的调控系统（因此需要额外的调控元件）。因此就需要人工构建一个载体，帮助外源基因进入宿主细胞，以及在宿主细胞中的复制、增殖、表达等。 外源基因进入宿主细胞会受到很多限制，如：外源DNA很难进入受体细胞（没有相应的转移体系）；外源DNA一般不带复制子系统（细胞增殖过程中就容易丢失）；外源DNA一般不具备表达的调控系统（因此需要额外的调控元件）。因此就需要人工构建一个载体，帮助外源基因进入宿主细胞，以及在宿主细胞中的复制、增殖、表达等。 理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。 1973年，美国加利福尼亚大学旧金山分校的波尔教授和斯坦福大学的斯坦力.科恩教授共同完成了一项著名的实验。他们选用了一个仅含有单一EcoRⅠ位点的质粒载体pSC101，并用EcoRⅠ将其切为线性分子，然后将该线性分子与同样具有EcoRⅠ粘性末端的另一质粒R6-3 的DNA片段用DNA连接酶混合，从而获得了具有两个复制起点位点的新的DNA组合。这是人类历史上第一次有目的的基因重组的尝试。 1973年，美国加利福尼亚大学旧金山分校的波尔教授和斯坦福大学的斯坦力.科恩教授共同完成了一项著名的实验。他们选用了一个仅含有单一EcoRⅠ位点的质粒载体pSC101，并用EcoRⅠ将其切为线性分子，然后