GFP在蛋白质相互作用研究中的应用.docx

1. GFP在蛋白质相互作用研究中的应用在活体内检测蛋白与蛋白相互作用，对我们理解生物学过程至关重要。研究蛋白质相互作用的经典技术是酵母双杂交系统。它是一个基于转录因子模块结构的遗传学方法，由Fields和Song等人于1989年首次建立，随后在蛋白相互作用研究领域广泛应用。酵母双杂交系统的实验过程，就是将已知蛋白作为诱饵蛋白，在系统中捕获与其相互作用的蛋白质。来源于水母的GFP在此系统中得到了广泛应用，人们可用它直接监测蛋白质与蛋白质的相互作用。科学家利用两个增强型GFP（EGFP）片段重建功能，从而开发出一种新型的报告系统以应用于酵母双杂交系统。该系统在基因水平上将EGFP片段分别与诱饵蛋白及要捕获的蛋白融合，在体内共表达，从而研究蛋白与蛋白间的相互作用。与现有的酵母双杂交系统相比，EGFP系统中的诱饵、靶蛋白载体的报告基因和复制控制元件均得到了改进。在酵母中，当蛋白与蛋白发生相互作用时，分开的EGFP能够重新结合而发出荧光(图7)1.1 构建分离的EGFP报告质粒以分离的EGFP作为酵母双杂交系统的报告基因有明显的优势，因为它不需要外源底物及辅助因子就能发出荧光。从理论上讲，该报告系统的基础是酵母中蛋白与蛋白间发生相互作用后，被分开的荧光蛋白片段会再次互相结合从而发出荧光。EGFP报告质粒包括pNEGFP和pCEGFP。构建模式见图8。在乙醇脱氢酶1（ADH1）启动子控制下，诱饵蛋白质粒编码的EGFP N-末端（NEGFP, 1-158位氨基酸）及靶蛋白质粒编码的EGFP C-末端（CEGFP, 159-239位氨基酸）能够被组成型表达，其转录被ADH1终止子序列终止。构建的EGFP报告质粒pNEGFP和pCEGFP分别为色氨酸和亮氨酸选择性，并且它们都是携带有低拷贝数起始位点（CEN6/ARS4起始位点）的着丝粒质粒。这些低拷贝数的质粒降低了蛋白表达水平，从而解决了酵母细胞中的蛋白毒性问题。为了克隆操作的方便，在质粒的多克隆位点（MCS）还引入了BamH I、Sal I及Pst I等其它克隆位点。另外，为了评价周围的结构域会否会产生空间位阻效应，研究人员还分析了由多种不同方法构建的EGFP报告系统，进行构象优化。下文将以酵母GAL4DD与GAL11P的相互作用为例，说明该系统的功能。1.2 以分离的EGFP为报告系统的酵母双杂交系统为了验证当酵母中的蛋白间发生相互作用时，被分离的EGFP会互补结合，研究人员以GAL4DD作为诱饵蛋白，GAL11P作为靶蛋白进行了实验。在蛋白与蛋白相互作用的研究中，经常使用这两种蛋白作为对照。实验中，研究人员将含有GAL11P的pCEGFP质粒（pCEGFP:GAL11P）与包含GAL4DD的pNEGFP:GAL4DD质粒一起转入酵母细胞，这样酵母就会含有pCEGFP:GAL11P和pNEGFP:GAL4DD两个质粒，这两个质粒均可用于研究荧光重建。另外，由于EGFP片段（NEGFP和CEGFP）的空间位阻效应可能会影响到荧光发色基团的形成，为了确定合适的融合蛋白空间结构，研究人员构建了不同组合的EGFP报告质粒，它们能够表达不同的EGFP片段组合（图9）。将NEGFP和CEGFP融合载体转入YM4217酵母中（该酵母是ura3-52、his3-200、leu2-3和trp1-901突变株），同时添加Ura、His、Leu和Trp。为了确定酵母细胞是否含有相应的质粒，采用表1中NEGFP和CEGFP融合蛋白特异引物进行PCR扩增。得到的PCR产物经1%琼脂糖电泳分离后，分别得到594bp（1N-5N）、474bp（6N）、513bp（1C-4C, 6C）、243bp（5C）的扩增产物。如图10a所示，相应的594bp（1N-5N）、474bp（6N）、513bp（1C-4C, 6C）、243bp（5C）PCR产物只存在于转入后的酵母中，不存在于用作对照的YM4217酵母中，这说明在酵母双杂交系统中可以使用不同的选择标记。为了确定酵母双杂交系统能否产生荧光，研究人员在共聚焦显微镜下观察表达NEGFP和CEGFP融合蛋白的YM4271酵母。计数发出荧光的酵母细胞后，他们发现在不同的NEGFP和CEGFP构建方式下，荧光重建效率不同，说明空间效应会影响荧光蛋白的互补结合。如图10b所示，以全长EGFP作为阳性对照，荧光重建率（R/E）为67%；而阴性对照，即未转染的酵母细胞根本不发出荧光。表2总结了相关的荧光重建率百分比。设定酵母细胞转染效率为100%，另外还评估了分离的EGFP相对于阳性对照的重建率百分比，数据为三个独立样品的平均值。如图10b和表2所示，以pNEGFP和pCEGFP两个空载体转染作为空白对照，EGFP重建率为14.9%。NEGFP:GAL4DD与CEGFP:GAL11P发生