基因工程作业之基因工程载体.doc

基因工程载体 ---乳酸菌表达载体pMG36e及其应用现状 目前，多数外源基因的克隆与表达，主要采用大肠杆菌。然而，由于大肠杆菌能够引起人类和动物发生不同程度的腹泻，导致机体损伤，所以其表达产物需要经过复杂的分离纯化才能达到食品医药标准。与之相比，乳酸菌作为人和动物肠道内正常菌群之一，已被证明具有诸多益生功能，而且被公认为安全无毒的 (Generally regarded as safe，GRAS)。因此，采用乳酸菌表达的外源蛋白质可免去上述复杂、繁琐的后提纯工艺；同时，乳酸菌可以在肠道中存活定植，其外源基因表达用于治疗或免疫作用的活性物质可以持续地在肠道中产生，成为人和动物体内功能性生物制剂的“加工车间”，从而起到相应的保护和治疗性作用。 乳酸菌（Lacticacidbacteria，LAB）是一类能够发酵糖类产生乳酸的革兰氏阳性细菌［1］，具有诸如缓解乳糖不耐症、调节消化道微生态平衡等益生作用，应用领域十分广泛。随着近二十几年来分子生物学的发展，以乳酸菌作为宿主，利用质粒表达外源基因，对乳酸菌进行改造以进一步提高其功能已成为目前的研究热点之一。乳酸菌常用质粒载体主要有pWV01衍生载体，pNZ系列载体［2］等。质粒pMG36e来源于pWV01载体，于1989年由VanDeGuchte［3］以乳酸乳球菌乳脂亚种蛋白酶基因的转录和翻译信号为基础构建而成，质粒大小约为3.6Kb，便于宿主携带，可表达被克隆的各种基因。目前已在乳球菌属 （Lactotoccus），链球菌属（Streptococcus），乳杆菌属（Lactobacillus）等中成功表达如溶菌酶、苯丙氨酸氨酶［４］、枯草杆菌中性蛋白酶［５］，以及超氧化物歧化酶［６］等以及其他蛋白基因，近年来也有学者［７］对其进行改造，成功构建了食品级载体。是目前应用较多的一个组成型表达载体。本文主要从载体构成，表达外源基因与构建食品级载体等三方面进行综述。 一、 载体的构成 载体 pMG36e由强启动子p32及其下游的部分开放阅读框、多克隆位点和来自乳酸乳菌乳脂亚种（Lactococcuslactissubsp.cremorisWg2）蛋 白 酶 基 因（prtP）［8］的转录终止子以及 pWV01复制子和来自于质粒pE194［9］的红毒素抗性基因Emr构成，质粒大小为3.6Kb。质粒pMG36e的构成使其有利于表达外源基因。其中强启动子P32于1987年由VanderVossen等［10］利用鸟枪法从乳脂链球菌（S.cremoriswg2）克隆得到，p32包括开放阅读框架和一个能够被大肠杆菌（E.coli）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、乳链球菌（S.lactis）识别的核糖体结合位点。pWV01复制子来源于广宿主乳球菌质粒 pWV01［11］，能在一系列细菌中行使功能，这其中包括大肠杆菌（E.coli），枯草杆菌 （B.subtilis）、乳球菌、乳杆菌、化脓性链球菌（S.pyogenes）和血链球菌（S.sanguis）等［3］。位于翻译启始信号下游的多克隆位点可使外源基因在合适的阅读框架内插入。由于大肠杆菌与枯草杆菌可作为构建重组质粒的中间宿主，这极大地提高了该质粒的表达效果和扩展了宿主应用范围。 二、利用pMG36e载体的基因表达 　自 20世纪 80年代 VanDeGuchte成功构建该质粒以来，已利用该载体表达动植物和细菌的外源基因达十几种，并成功构建了多种具有特定功能的基因工程 乳酸菌。 2.1　细菌素基因的研究 　　与抗生素相比，大部分细菌素只对近缘关系的细菌有损害作用，安全性比较高，因此对细菌素作用机制的研究有很重要的意义。1996年，Franke等［12］用 pMG36e表达与β-半乳糖苷酶（β-Galactosidase）融合的细菌素转运与成熟相关的lcnD基因，以研究乳球菌素运输机制。Diep等［13］将载体 pMG36e和其衍生载体pMG37e用于戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus）细菌素诱导基因中的penIR和penIF的表达和免疫基因结构基因诱导基因簇peiA penA penI RKR的表达研究。2007年该研究小组，又将pMG36e用于乳球菌素A（lactococcinA）研究，证明其利用甘露糖磷酸转移酶系统作为受体。除此以外，pMG36e也用于植物乳杆菌素（plantaricin）423免疫蛋白的表达研究，和作为中间载体探讨乳链菌素（nisin）抗性机制以及用于表达肠道菌素（enterocin）AS48的as48ABCRNA片段。 2.2酶类的研究 2.2.1溶菌酶　VanDeGuchte等［14］在成功构建质粒pMG36e后，插入一段母鸡溶菌酶（HEL）蛋白编码序列，构建质粒p