王老师组《生物技术大实验》讲义.doc

第一部分 Taq DNA聚合酶基因的克隆、载体构建和大肠杆菌工程菌的制备 【原理和技术路线概述】 实验二 Taq DNA聚合酶基因的克隆 【实验目的】 学习利用PCR技术扩增目的基因编码框的方法 学习在PCR扩增目的片段两端添加限制性内切酶识别位点的方法 【实验原理】 略 【仪器与试剂】 1．实验器材 ??PCR自动扩增仪，离心机，微量移液器，制冰机 0.2ml薄壁Eppendorf管（消毒），200μl枪头（消毒） 2. 试剂 ?? ?? 10×PCR缓冲液 ?? dNTPs：????dATP，dCTP，dGTP，dTTP各2.5mmol/L ???? Taq酶：2.5U/μl ???? 模板DNA：0.1μg/μl 25mmol/L MgCl2 去离子水(ddH2O)（消毒） 石蜡油（消毒） 引物序列(浓度：10μmol/L) ?引物P1(氨基端引物Taq-T)： 5-CACGAATTC/GGGGATGCTGCCCCTCTTTGAGCCCAAG 引物P2(羧基端引物Taq-R)： 5-GTGAGATCT/ATCACTCCTTGGCGGAGAGCCAGTC 【实验步骤】 （一）?准备PCR反应溶液 1.取薄壁0.2ml Eppendorf管1只，用微量移液器按以下顺序分别加入各试剂: 10×缓冲液 2.5μl 10×dNTP 2μl 引物P1 1μl 引物P2 1μl 模板DNA 1μl Taq酶 0.5μl ddH2O xμl 总体积 25μl ? 2.用手指轻弹Eppendorf管底部，使溶液混匀。在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底； 3.加石蜡油一滴封住溶液表面(有热盖功能的PCR仪可不加)； （二）PCR扩增反应 ????? 将加好样品的Eppendorf管插在PCR自动扩增仪样品板上，94℃ 3分钟，使模板充分变性。然后按以下步骤在PCR自动扩增仪中进行反应，30个循环(约需2.5小时)； ?????? 94℃ 2分钟 ???????94℃ 1分钟 ???????55℃ 1分钟???? 35个循环 72℃ 2分钟 72℃ 10分钟补平 反应完毕，将样品取出置于-4℃中待用。 （三）取3μlPCR 产物做电泳分析（2500bp） 实验三 Taq DNA聚合酶基因扩增片段的回收、片段与载体的限制性内切酶的酶切 【实验目的】 学习PCR产物的回收原理及方法 学习DNA的限制性内切酶酶切方法 【实验原理】 略 【仪器与试剂】 1．实验器材 ??37℃恒温箱，离心机，微量移液器 1.5ml薄壁Eppendorf管（消毒），200μl枪头（消毒） 2. 试剂 PCR产物回收试剂盒 限制性内切酶EcoRI, BamHI及缓冲液 【实验步骤】 PCR产物的回收 见试剂盒说明书。 PCR产物及载体的限制性内切酶酶切 在两只灭菌的1.5ml Eppendorf管中分别加入下列试剂： DNA(pUC18质粒) 10μl(2μg) 酶切缓冲液 5μl EcoRI 2μl BamHI 2μl ddH2O xμl 总体积 50μl 管1： 管2： DNA(PCR产物) 10μl（2μg） 酶切缓冲液 5μl EcoRI 2μl BglII 2μl ddH2O xμl 总体积 50μl 2.37℃保温1-3小时。 3.65℃水浴处理10分钟，终止酶切反应。 【结果、分析及注意事项】 （1）酶切时，应尽量减少反应中的加水量以使反应体系减到最小。但要确保酶体积不超过反应总体积的十分之一，否则限制酶活性将受到甘油的抑制。 （2）进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后再从冰箱中取出酶，并应放置于冰上。每次取酶时都应换一个无菌吸头 。操作要尽可能快，用完后立即将酶放回冰箱。 实验四 载体和片段的琼脂糖凝胶电泳、回收及连接 【实验目的】 学习DNA片段的琼脂糖凝胶回收原理及方法 学习DNA片段体外连接的原理及方法 【实验原理】 BamHI和BglII的酶切产物具有相容性末端，可以相互连接 5-G^G A T C C-3 3-C C T A G^G-5 5-