5DNA序列测定概述.pptVIP

* 第三节 DNA测序的自动化和大规模测序 ① 文库构建 ② 转化 ③ 培养 ④ 模板制备 ⑤ 电泳检测模板 ⑥ 测序反应 ⑦ 毛细管电泳测序 ⑧ 数据收集处理 1 1 DNA序列测定 DNA 序列测定方法 Sanger 双脱氧链终止法 Maxam-Gilbert 化学修饰法 第一节 Sanger双脱氧终止法 (chain-terminator method) 一、原理 二、DNA序列测定的策略 一、原 理 在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP）,由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA的核苷酸序列。 Sanger 双脱氧链终止法 2.Sanger法DNA测序的试剂 ① 引物：通常由20-23个碱基构成，G+C=12，A+T=8到11，Tm=60-68℃，避免形成引物二聚体或形成发卡样结构 ② 模板 ③ DNA聚合酶 ④ 2′，3 ′-双脱氧核苷三磷酸 （ 2′, 3 ′-dideoxynucleoside triphosphate, ddNTP ） ⑤ dNTP