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Western blot 技术 主要内容 Western blot 定义 Western blot 特点 Western blot 原理 Western blot 实验过程 Western blot 应用 Western blot 定义 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。 Western blot 特点 蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。 Western blot 原理 原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 Western blot 实验过程 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶 电泳 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显影 曝光、显影、定影 蛋白样品的制备 制备的主要原则是尽可能溶解全部蛋白质，打断蛋白质与蛋白质间的相互作用，避免各类干扰物质 用预冷的PBS漂洗细胞两次，弃洗液并吸尽残余液体。 加入细胞裂解液，用细胞刮刀刮下细胞，由于染色体DNA的释放，溶液变得很粘稠，将裂解产物吸入1.5ml离心管。整个过程必须在冰上进行,防止蛋白降解。 超声剪切染色体DNA,直至溶液不再粘稠为止。 超声的频率，时间，次数，不能起泡沫，探头应插入液面以下。 4度离心机离心，10000rpm，10分钟 (或12000rpm,2分钟)。分三层：上层为油脂，中层为蛋白质，下层为沉淀。 将上清移入另一Eppendorf管，存于-80°C冰箱保存。 加入蛋白上样缓冲液并置于沸水浴中加热3-5分钟，变性待用。 50mmol/L Tris.HCl (PH=7.4) 150mmol/L NaCl 0.02% 叠氮钠 0.1% SDS 100ug/ml PMSF(苯甲基磺酰氟) 1ug/ml Aprotinin (牛胰蛋白酶抑制剂) 1% NP-40 1mM EDTA 1%去氧胆酸钠 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS 是一种离子型的表面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性氨基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定比例之SDS后,由于 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素。 聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 丙烯酰胺(Acr)和N,N’-亚甲双丙烯酰胺(Bic)（避光，现配现用） 10%SDS Tris?HCl TEMED （避光） 10%过硫酸铵 （现配现用） 去离子水 操作图示 western常用胶为不连续、变性SDS-聚丙烯酰胺胶，上层为浓缩胶，下层为分离胶。 配制分离胶用水封液面时，注意加水需轻柔,沿玻璃缓缓流下,而不能砸下,保持分界处的平直,以及交接面不会被水所稀释,影响蛋白分离效果及条带的美观性(也可以用异丁醇)。 引发剂及增速剂用量需适当，胶凝聚的时间控制在30min到1h为宜。 在已聚合的分离胶上灌注浓缩胶，立即插入干净梳子，小心避免混入气泡。 转膜 电泳结束后，取出凝胶进行转膜，转膜方法可选择湿法转移和半干法转移。 常用的膜是NC膜和PVDF膜。 转膜 半干转膜实验步骤： 先将PVDF膜在甲醇中浸泡约30s,在放入转膜缓冲液里浸泡数分钟。每块胶用60mA，1h，从下到上的顺序：阴极/滤纸/PVDF膜/凝胶/滤纸, 凝胶面向阴极，保持湿润和没有气泡。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带转移到膜上的效率。 转膜 湿转实验步骤： 将膜，凝胶放置到湿转夹子中，膜面向正极，凝胶面向负极，100V稳压转膜1.5小时，时间和电压可以根据转移蛋白质分子量进行相应调整，转膜后丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带转移到膜上的效率。