端粒与端粒酶__培训课件.ppt

* 第一，端粒酶活性调节的确切机制还不清楚，不同的抑制剂对同一种细胞或同一种抑制剂对不同的细胞的抑制作用都不相同，如何针对不同的肿瘤选择最有效的抑制剂，还需要进一步研究。 第二，除恶性肿瘤细胞有端粒酶活性的表达外，正常人类生殖细胞、造血干细胞、外周血白细胞、表皮细胞等具有再生能力的细胞也有不同水平的端粒酶活性表达，所以端粒酶抑制剂的毒性评价也是一个非常重要的问题[25]。 第三，迄今为止绝大多数的抗端粒酶研究都是在体外进行的，如何建立合适的动物模型还有待研究。 第四，从端粒酶活性的抑制到肿瘤细胞的凋亡有一个过程，这期间肿瘤可以持续生长，对机体产生致命伤害，因此如何缩短这一过程提高疗效也是至关重要的。 反义核苷酸封闭hTR 为了提高抗反义核酸降解和进入组织细胞的能力， Piytts 等设计了一种甲基化的反义 RNA（ 2’-O-methyl-RNA ），用阳性脂质将其导入人前列腺肿瘤细胞系DU145，使细胞的端粒酶活性减少了97% 有学者发现，用硫代反义核苷酸活性，还能抑制淋巴瘤细胞系OMABL1的生长，诱导细胞凋亡 反义肽核酸封闭hTR　 肽核酸（peptide nucleic acids,PNA）是一类人工合成的DNA或RNA类似分子 PNA与核酸分子的不同之处在于：将DNA中的磷酸脱氧核糖骨架被酰胺键连接的多肽骨架所代替，碱基通过亚甲羧基链与骨架中甘氨酸的氨基连接 PNA具有与天然DNA相类似的结构特征和相同的DNA/RNA结合特性 PNA与DNA结构比较 骨架由 N-（ 2-氨基乙基）甘氨酸构成 碱基通过亚甲羧基链与骨架中甘氨酸氨基连接 PNA对DNA或RNA的亲和力较相应DNA与DNA 和 DNA与RNA之间的亲和力高 在100mmol/L NaCl 溶液中，每碱基的Tm值约升高5℃ 导致PNA-DNA双链和PNA-RNA双链的Tm值升高的原因是由于 PNA-DNA和 PNA-RNA 中两条单链之间缺乏静电排斥力 PNA-DNA 和PNA-RNA双链的方向可以是同向平衡，也可以是反向平衡，反向平衡时Tm值更高 不同盐浓度对杂交分子Tm值的影响  NaCl浓度 PNA/DNA DNA/DNA0 mmol/L 72℃ 38℃ 140 mmol/L 69℃ 56℃ 1000 mmol/L 65℃ 65℃   反义肽核酸封闭hTR PNA不带电荷，中性骨架间无排斥力，使之具有比DNA寡核苷酸更强的结合力和抗蛋白酶和核酸酶降解能力 Norton等，设计了针对hTR模板区的不同长度的PNA，发现其对端粒酶活性的抑制在一定长度范围内随链的延长而增强 PNA的高度亲和性、高度特异性和抗降解能力，使之成为极具潜力的抗肿瘤新药 锤头状核酶切割hTR序列　　 核酶是一类具有酶活性的小分子RNA，通过序列特异性地与靶RNA分子配对，对底物进行切割，从而使其失去生物学功能 Wan等，合成了一种甲基化修饰的锤头状核酶（2’-O-methyl-modified hammerhead ribozymes），具特异性切割hTR模板区序列的功能 核酶：四膜虫 rRNA自我剪切 锤头状核酶切割hTR序列 将该酶与人神经胶质瘤U87-MG 细胞系的细胞抽提物共同孵育，端粒酶活性受到明显抑制，这种抑制作用具有剂量依赖效应 Yokoyama等，设计了针对人端粒酶RNA模板区的锤头状核酶，能有效切割非细胞体系中的RNA底物，将其导入子宫内膜癌细胞后，可明显抑制端粒酶活性 抑制端粒酶活性——抑制端粒酶催化蛋白亚单位 Horikawa等发现：将正常人3号染色体导入人肾癌细胞系RCC23，可引起其端粒酶活性的抑制、端粒的进行性缩短和细胞的老化，并且证实端粒酶活性的抑制是由于编码hTERT的基因的下调引起的，提示：3 号染色体上存在直接或间接控制hTERT基因表达的基因 最近大量研究表明：端粒酶三个主要组成成分中 hTERT与肿瘤的关系最密切，已成功将其克隆 hTERT有望成为肿瘤基因治疗的新的理想靶点 抑制端粒酶活性——核苷类似物竞争性抑制反转录　 端粒酶具有反转录酶活性，在催化合成端粒DNA的过程中，需要有4种 dNTP的参与 利用核苷类似物?竞争性抑制反转录过程?抑制端粒酶活性?阻止端粒延长 抑制端粒酶活性——核苷类似物竞争性抑制反转录 Strahl等发现：双脱氧鸟嘌呤核苷（dideoxyguanosine，ddG）可使永生化的人淋巴细胞株 JY616 和 Jurkat E6-1的端粒发生进行性缩短和端粒酶活性的明显抑制，而且ddGTP也有类似的抑制作用 抑制端粒酶活性——核苷类似物竞争性抑制反转录 Melana等在培养基中加入