pepc酶活的测定题稿.docVIP

2. 实验试剂： 50mM ATP溶液，50mM磷酸肌酸溶液，0.2mM NaHCO3溶液，160U/ml磷酸肌酸激酶溶液，160U/ml磷酸甘油酸激酶溶液，160U/ml磷酸甘油醛脱氢酶溶液（U为酶活力单位），25mM RuBP溶液，5mM NADH，Rubisco提取介质（40mM Tris-HCl缓冲液，pH7.6，内含10mM MgCl2溶液，0.25mM EDTA，5mM谷胱甘肽），反应介质（0.1M Tris-HCl缓冲液，pH7.8，内含12mM MgCl2溶液，0.4mM EDTA）。 3实验步骤 3.1 酶粗提液的准备 取新鲜洗干净的条斑紫菜的丝状体和条斑紫菜的叶状体各1克，加入预冷的提取介质1ml，冰浴研磨10min，将样品在40C，10,000×g离心10min，弃沉淀；上清夜即是酶粗提液，置于00C备用（王维光，1985；张志良等，2003）。 3.3.2 Rubisco酶活力的测定 按下表配制反应体系： 试剂 加入量ml 5mM NADH 0.2 50mM ATP 0.2 酶提取液 0.1 50mM磷酸肌酸 0.2 0.2mM NaHCO3 0.2 反应介质 1.4 160U/ml磷酸肌酸激酶 0.1 160U/ml磷酸甘油酸激酶 0.1 160U/ml磷酸甘油醛脱氢酶 0.1 双蒸水 0.3 将配制好的反应体系混匀，倒入比色杯内，以蒸馏水为空白，在紫外分光光度计计上测量340nm处反应体系的OD值，作为零点值。将0.1mlRuBp加入比色杯内，立即计时，每隔20s测一次OD值，共测3min。以零点到第1min的OD值下降的绝对值计算酶活力。 由于酶提取液中可能存在3-磷酸甘油酸（PGA），会使酶活力的测定产生误差，因此除上述测定外还需做一个不加RuBp的对照。对照的反应体系与上述酶的反应体系完全一样，所不同的仅仅是把酶提取液放在最后加，加入后马上测定此反应体系340nm处的OD值，并记录前1min内OD值的变化量。计算酶活力变化时应减去这一变化量。 3.3.3 Rubisco活力的计算 酶活力=（ΔODN10）/（6.22×2dΔt） 式中：ΔOD为反应最初1min内340nm处OD值变化的绝对值（减去对照液最初1min的变化量）；6.22为每mmol NADH在340nm处的光密度；N为酶液稀释倍数；2表示每固定1mol的CO2有2mol的NADH被氧化；d为比色杯光程（cm），Δt表测定时间为1min；酶活力单位为mmolCO2/ml(酶液).min。 ·h 4 条斑紫菜丝状体和条斑紫菜叶状体磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）活性差异的研究 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶广泛存在与高等植物、细菌以及藻类中，催化磷酸烯醇式丙酮酸和碳酸氢根形成草酸乙酸，该反应不可逆，是C4植物光合途径中的关键酶，起着固定原初CO2的作用。在细菌中对三羧循环起着调节作用。本实验用偶联法测定酶的活性。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在PEP、H2CO3、Mg2+存在时，形成草酸乙酸，而草酸乙酸在NADH及苹果酸脱氢酶存在下可生成苹果酸及NAD，NAD形成的速度可在340nm处进行测定，并以OD值下降0.01作为一个酶活性单位。 mM EDTA（292 mg/L），5%的甘油]，洗脱缓冲液[10mM Tris-H2SO4缓冲液，含0.2mM EDTA（58 mg/L），0.2mM二硫苏糖醇（31 mg/L），5%的甘油，pH8.2]，反应缓冲液[50mM Tris-HCl缓冲液，pH9.2]，反应混合液[0.5ml 70mM Mg SO4（17.3mg/L），0.5ml 70mM NaHCO3，1ml 14mM PEP（2.9 mg/L）混合，以上溶液都用反应缓冲液配制。需用时再加入1.5ml内含0.35mg NADH及过量的苹果酸脱氢酶的反应缓冲液]。 4.2实验步骤 4.2.1 酶提取液的准备 取新鲜洗干净的条斑紫菜的丝状体和条斑紫菜的叶状体各1克，加入预冷的提取介质1ml，冰浴研磨10min，将样品在40C，10000×g离心10min，弃沉淀