异养硝化细菌的分离筛选与特性测试.docVIP

南昌大学实验报告 学生姓名： 冯 涛 学 号：5802112013 专业班级： 环境工程121班 实验类型：√ 验证 □ 综合 □ 设计 □ 创新 实验日期：2014.6.9实验成绩： 异养硝化细菌的分离纯化及其 硝化特性的测定实验设计 一、实验目的： 1．从活性污泥中中分离培养异养硝化细菌，掌握常用的分离和纯化方法； 2.认识并了解本实验培养基的组成； 3. 掌握FISH试验验证所分离的硝化细菌，掌握氮轨迹跟踪试验来测试分离筛选的纯化菌株在好氧条件下的硝化性特性能力。 二、实验基本原理： 废水生物脱氮是目前水处理领域中关注和研究的热点，其中对异养硝化作用及其菌属的研究，是对传统硝化理论的丰富与突破。相对于自养硝化菌而言，虽然有的异养菌的分解效率较低，但是由于它们在环境中的数量以及生长速率上往往远大于自养菌，因此在某些环境之中，异养硝化作用的贡献可以与自养菌相当，甚至超出。关于异养硝化作用，虽然目前仍有很多机理未得到解释，对一些现象的解释也不尽圆满，但异养硝化作用的重要性日益受到关注。 本实验在膜生物反应器(Membrane Bioreactor，MBR)实现稳定高效同步硝化反硝化(SimultaneousNitrification and Denitrification，SND)效果的基础上，采用将传统微生物学方法与现代分子生物学手段相结合的新型异养硝化细菌分离筛选方法，对系统中异养硝化细菌进行了分离筛选，通过生理生化实验、16S rDNA序列分析，对分离筛选获得菌株进行了分析。同时采取批式实验对分离菌株的异养硝化性能进行了进一步的试验研究，为开发设计新的脱氮工艺，提高脱氮效率，提供一定理论及技术基础。 三、主要仪器设备及耗材： 1.无菌物品：包括各种玻璃器皿，锥形瓶，移液管，牛肉膏-蛋白胨固体培养基，酒精灯等； 2.恒温振荡器，接种环，超声波仪，荧光共焦激光扫描显微镜； 3.玻璃珠，无菌水，蒸馏水，50%，80%，98%，99.5%酒精。 四、实验步骤： 材料与方法 1．1菌种来源取自运行稳定且具有80．1％SND效果的MBR系统 1．2异养硝化细菌的分离筛选 1．2．1分离平板 牛肉膏-蛋白胨固体培养基，其配方为：牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂15～20g/L。 1．2．2样品的稀释 吸取MBR中活性污泥20mL加入到盛有180mL的无菌蒸馏水和玻璃珠(分散用)的500mL三角瓶中，塞上灭菌的棉花塞，于恒温振荡器上以100r/min转速30℃下振荡10h，而后进行10倍浓度梯度稀释至10的负十次方。 1．2．3细菌的纯化分离 在制备好的牛肉膏一蛋白胨固体培养基上，从各个稀释度的稀释液里均取0．1mL分别稀释涂布至固体平板上(每个稀释度3个重复)，于生化培养箱30℃下培养。在形成菌落的平板内，挑选出大约100个单菌落的平板。将单菌落用接种环挑出，划线分离。待形成菌落后，再用接种环移植到固体培养基上，30℃条件下培养，然后挑取一接种环的细菌菌苔放到无菌水中，充分振荡。用此细菌悬液，按照活菌数测定方法在平板上涂布，使其在培养皿上形成30～50个单菌落，而后把单菌落按照上述方法再挑菌一次，反复2～3次。并以不接菌的平板做空白对照。 1．2．4液体纯培养的硝化活性验证 将牛肉膏-蛋白胨固体培养基上生长的纯菌菌苔用接种环挑取适量接种于氨氧化能力鉴定培养基：葡萄糖5g/L，(NH4)2S04 0．5g/L，NaCl 0．3g/L，K2HP04 1．0g/L，MgS04·7H200．3g/L，FeS04·7H20 0．03g/L，CaC03 7．5g/L，30℃条件下振荡培养，培养期间每隔3d取2mL培养液至洁净试管，将格利斯试剂1～2滴直接点滴入试管中进行硝化活性确认，并以不接纯化菌株的氨氧化能力鉴定培养基作空白对照。如现红色乃至褐色，则说明由于硝化作用而积蓄了亚硝酸盐。2～3min后再在未显色的试管中加入锌粉少许，静置，观察是否呈现红色。如加入锌粉后显红色，则说明培养液中的产生了硝酸盐。即菌株也具有硝化活性，初步确认为硝化活性菌。 1．3荧光原位杂交技术检验验证所分离的异养硝化细菌 本实验根据自养硝化细菌16S rRNA序列设计的探针Ns01225(CGCCATTGTATTACGTGTGA)为变形细菌β-proteobacteria类的通用探针；探针NIT3(CCTGTGCTCCATGCTCCG)可检测出Nitrobacter类的硝化杆菌怕。使用的探针EUB338(GCTGCCTCCCGTAGGAGT)为样品总菌数的检测，以确保样品中有足够检出量的rRNA。具体检测过程如下。 1．3．1预处理及固定