高二生物基因工程的基本操作程序苏教版知识精讲.doc

高二生物基因工程的基本操作程序苏教版 【本讲教育信息】 一. 教学内容： 基因工程的基本操作程序 二、良好开端 本节重点：基因工程基本操作程序的四个步骤。 本节难点：（1）从基因文库中获取目的基因。 （2）利用PCR技术扩增目的基因。 （3）基因表达载体的构建 （4）将目的基因导入不同生物体的方法 三、成功之旅 【知识点1】目的基因的获取 获取目的基因是基因工程的第一步。 1. 目的基因：符合人们需要的，编码蛋白质的结构基因。 2. 获取目的基因的方法 （1）从基因文库中获取目的基因 ①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 ③目的基因的获取 根据基因的有关信息：基因的脱氧核苷酸序列、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因的翻译产物蛋白质等特性获取目的基因。 优点：有了基因文库，就可随时从中提取所需要的目的基因，引入受体细胞使之表达。 （2） 人工合成法：如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法人工合成。 ①反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。 ②人工合成：根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。如人的血红蛋白基因、胰岛素基因等就可以通过人工合成基因的方法获得。 （3） 利用PCR技术扩增目的基因。 ①PCR：PCR是聚合酶链式反应的缩写。这项技术是由穆里斯等人于1988年发明的，为此，穆里斯于1993年获得了诺贝尔化学奖。它是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以获取大量的目的基因。PCR扩增是获取目的基因的一种非常有用的方法，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。 ②目的：获取大量的目的基因。 ③原理：DNA复制。 ④条件：已知目的基因的核苷酸序列即模板DNA、RNA引物、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）、离子。 ⑤方法：DNA受热变性解旋为单链、冷却后RNA引物与单链相应互补序列结合，在DNA聚合酶作用下延伸合成互补链。 ⑥特点：指数扩增=2n（n为扩增循环的次数） ⑦过程：如图所示。主要包括变性、复性、延伸、重复四个过程。 步骤名称 需要的温度 过程 第一步 变性 90～95℃ 将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸以及酶促反应所需要的离子等）加热至90～95℃，使双链DNA模板两条链之间的氢键打开，变成单链DNA，作为互补链聚合反应的模板。 第二步 复性 55～60℃ 将反应体系降温至55～60℃，使两种引物分别于模板DNA链3端的互补序列互补配对，这个过程称为复性。 第三步 延伸合成 70～75℃ 将反应体系升温至70～75℃，在耐高温的DNA聚合酶的催化作用下，将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3’-OH上，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的DNA链。 上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。 例1、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是（ ） ①从基因文库中获取目的基因 ②利用PCR技术扩增目的基因 ③反转录法 ④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成 A. ①②③④ B. ①②③ C. ②③④ D. ②③ 答案：D 【知识点2】基因表达载体的构建 基因表达载体的构建是基因工程的第二步，也是基因工程的核心。 1. 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；使目的基因能够表达和发挥作用。 2. 表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因等。 ①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA 聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录产生mRNA。 ②终止子：位于基因的尾端，终止DNA的转录。它就相当于一盏红色信号灯，使转录在需要的地方停下来。 ③标记基因：它的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素基因就可以作为这种基因。 3、构建步骤 ①用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个有黏性末端的切口。 ②用同种限制酶切割目的基因，产生相同的黏性末端。 ③将切下的目的基因片段，插入质粒的切口处，再加入适量的DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒。 不同的受体细胞及目的基因导入受体细胞的方法不同，在基因表达载体的构建上