第三章、细胞工程基本技第三章、细胞工程基本技术.pptVIP

血球计数板 计数法 细胞固定与染色观察 细胞固定 甲醇-醋酸 FAA Carnoy 细胞染色 苏木精-伊红（H.E)染色法 Giemsa染色法 Feulgen染色法 考马斯蓝染色法 免疫荧光法 免疫过氧化物酶染色法 凋亡细胞观察 形态观察: 生化分析: 锚定蛋白:检测凋亡早期 PI:检测晚期或死细胞 分子技术:梯形电泳图谱 形态观察 PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面 FITC-AnnexinV染色 FITC-AnnexinV和PI染色 梯形电泳图谱 染色体分析 样品处理:秋水仙素 低渗处理 固定化 染色观察 细胞分离 细胞初步分离 差速离心分离法 单个细胞的获得 软琼脂培养法 和 有限稀释法 显微操作分离法 流式细胞仪分离 激光捕获显微切割 免疫磁珠分离 琼脂平板培养 琼脂平板（培养淋球菌） 多孔板培养 流式细胞仪原理 激光捕获显微切割 免疫磁珠分离 细胞保存与复苏 目前广泛应用的细胞保存方法是低温冷冻保存法 预保留细胞经消化分散后，加入冷冻保护液，同时将细胞悬液稀释 按1ml/安瓿分装细胞悬液，在火焰下将安瓿封口。 将封口的安瓿放入慢冻机内，按1℃/min的速度缓慢冷冻，使温度降至-25℃ 冻结好的安瓿放入CO2低温冰柜或液氮罐中，温度达-150—- -190 ℃ 如果需要复苏，可将安瓿取出后立即放入37 ℃水浴中，使其快速融化 思考题 植物组织培养的基本实验室有哪些？实验室布局的基本要求是什么？ 消毒灭菌种类有哪几类？ 使用高压锅的基本步骤是什么？ 用血球计数板进行计数时，细胞数/L=N*25/5*10*10^6*稀释倍数，N指什么？ 对细胞进行染色体分析中，样品处理时加秋水仙素起什么作用？ 简述细胞低温冷冻保存的方法 培养架 光照培养箱 摇床 生物反应器1 生物反应器2 植物细胞培养反应器 显微镜 无菌技术 无菌技术是一个技术体系，涉及多方面因素、多个环节，只有诸因素和环节都处理好，才能达到无菌。 培养基 器皿材料 接种工具 操作环境 培养室 工作台面 具体的灭菌方法有多种 污染检测与控制 玻璃器皿清洗 浸泡——刷洗——浸酸——冲洗 常用器械 无菌室 无菌操作室和无菌培养室 要求：墙壁光滑、地面平坦无缝，门窗密闭，无空气对流 培养室1 培养室2 工作台面 灭菌种类 物理灭菌：高温高压灭菌、干热灭菌、射线辐照灭菌、过滤灭菌 化学灭菌：熏蒸灭菌、消毒液灭菌（酒精、升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢） 抗生素消毒：在动物细胞培养中，常采用青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等抗生素抑制细菌、真菌等污染。 根据灭菌对象选择不同的灭菌方法 高温高压灭菌 原理：在121℃高温和0.8kg/cm2-1.1kg/cm2的压力下，一般持续15-20分钟后，就可杀死一切微生物的营养体及其孢子。 适用于器皿、工具、衣物和培养基灭菌。 干热灭菌法 　　　将物品放入烘箱，利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固而达到灭菌的目的。 　　适用于玻璃器皿。 烘箱 射线灭菌 　　紫外光常用于培养室和接种箱或超净台的灭菌。操作前开灯20分钟可达到灭菌效果。 过滤灭菌 原理：将带菌的液体或气体通过孔径小于0.45uM微孔装置，使杂菌留在滤板上而液体或气体进入无菌空瓶中，从而达到除菌目的。 常用于不能以高温高压灭菌的培养液、有机物质溶液和酶液的除菌。 组织培养中常用的过滤除菌器是滤膜过滤器，它清洗方便，过滤效果好。 过滤除菌装置 熏蒸灭菌 　　　用能杀死微生物的蒸汽进行灭菌，适用于无菌室的定期灭菌。 　　　常用的方法是将甲醛和高锰酸钾混合后，产生大量蒸气，以杀死微生物，效果较好。 消毒液灭菌 依化学灭菌剂的不同而适用于不同场合的灭菌。 　　70%酒精几乎适用于组织培养中如各种器皿、培养材料、无菌室、接种箱、工作台、操作人员的手等； 　　升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢、抗菌素等适用于培养材料的灭菌。 室内灭菌 2%的新洁尔灭擦洗， 70%乙醇喷雾， 紫外灯照射约20分钟 定期用甲醛和高锰酸钾熏蒸 试剂和器皿的灭菌 包括培养基、特殊药品和所有无菌操作使用的器皿的灭菌 培养基通常使用灭菌锅通过高压蒸汽灭菌进行灭菌 灭菌锅种类 　立式、卧式和手提式 操作步骤：加水 装料 密封 排气 升压 灭菌 降压 取物品 放水 污染检测与控制