实时定量PCR..docVIP

实时定量PCR用于基因的定量分离 前言：目前许多关于定量PCR的实验报道证实了定量PCR由一门实验技术向科学研究的大的方向的转变。定量PCR有许多用途：测量mRNA表达的水平，DNA的拷贝数目，转基因的拷贝数目和表达分析，等位基因的鉴定和测量滤过性病毒的浓度测定。实时定量PCR的用途的应用范围非常广阔，而且它能够对菌种的增殖过程中低成本的反应器和反应物进行检测。成功的运用实时定量PCR并不是需要耗费很大的资金。这一篇综述能够通过限制这种技术的多种因素的分析来引导读者。对实验设计，模板准备，分析方法仔细的考虑对于精确的基因定量分析是非常重要的。 正文：在网上通过搜索关键词“定量PCR”或者“实时PCR”可以得到几千个结果，这足可以证明这项技术已经成为许多科学领域的主流研究方向。如果同一个搜索要在几年以前完成，那么得到的搜索结果只有几百个。是什么原因使得运用这种实验技术的论文增加的如此之快呢？第一个有关于实时PCR的文献发表于1993年[1]，那个时候这种实验技术还没有成为主流的实验技术。最主要的原因可能是实验仪器资金上巨大的耗费，而且在运用实时定量PCR研究可增殖的对象时候麻烦会更多，而实时PCR最近才被广泛的运用为一项有用的技术。随着市场上实时PCR仪器越来越多，这类仪器和反应物的价格也越来越便宜，更多的人现在选择了这项技术。将标准PCR甚至半定量PCR的知识简单的拓展已经不足以设计和分析这类试验。在运用实时PCR时候再也不是仅仅看到凝胶上面的一个条带就足以了，要得到一个确定的结果还需要更多调控。 PCR反应能够对模范链进行指数似的拷贝。由于反应过程中模板，反应物的限制，或焦磷酸分子产物对于DNA聚合酶的抑制作用，以至PCR反应最后不能够指数似的拷贝模板，而且其他反应的产物会产生比目的产物更多。这是为什么PCR反应终止时候的产量总是难以确定。能够对在PCR反应正在聚集的过程中产量的进行测量，或者能够实时的测量，那么就能够在PCR指数期反应的时候测量某一个点的产物的量。也只有通过指数期反应外推回去才能够知道起始的模板的数量。在实时PCR反应的指数期通过所有样品的比较而确定了一个荧光信号起始值。这个起始值能够作为参照的荧光值,并且当样品信号明显的大于参照的荧光值这个荧光信号起始值就被绘在图上。因此，PCR循环的每一个部分需要产生足够的荧光信号才能够达到这个起始值所经历的循环数目，或者Ct（cycle threshold）。Ct值正比于起始的模板的数量而且也是计算mRNA表达水平或者DNA拷贝数的计算的基础。 什么是实时定量PCR？ 实时定量PCR是对聚合酶链式中正比于反应前模板数量的反应产物的一种可靠的检测方法和测量方式。要达到这个目的，需要有一种检测PCR反应聚集产物的方法和一台能够执行热循环并且能够实时记录每一个PCR循环结果的仪器。在实时PCR仪器问世以前，要完成定量PCR，需要在以经验判断PCR循环的数目内用溴化乙锭（Ethidium Bromide）（或者其他的能够插入碱基的染料）插入DNA碱基对之间将PCR产物可视化。这些产物需要在标准的琼脂糖凝胶上跑电泳还要通过光电成像或者其他的密度测量方式使产物量化。后来极具竞争力的PCR反应拥有一些定量的能力，但是即便拥有这些办法仍然还不能够称为方便，稳定，可以信赖的定量方法。 第一篇报道实时PCR的实验，1993年Higuchi在PCR反应过程中通过溴化乙锭的插入和一台经过改良的热循环仪，用UV射线照射样品然后通过CCD相机检测产生的荧光值。检测的荧光信号值被作为检测PCR反应周期的一种手段。经过绘图的结果（如图1所示），该图对PCR每一个循环的产物数量给予了一个很好的预测（除了那些早期循环时候荧光信号值处于CCD相机识别范围以下）。这种方法的主要缺陷，不是采用强烈致癌物类似于溴化 图一：一个假设的扩增图谱阐明了实时定量PCR实验中术语的应用。这个扩增图以荧光信号和PCR循环数目为轴作图。基线是指信号开始聚集的PCR循环数而位于仪器的识别范围之内。在PCR循环中测量的信号用于绘制起始值。起始值一般为对应荧光信号基线平均信号值的标准偏移值的10倍。在标准值上方被发现的荧光信号能够被用来定义一个样品的起始周期（Ct）。Ct值定义为每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。不同样品的Ct值用于计算每一个样品的相应的模板含量。图中实线跨过PCR循环数目18的起始值点划线跨过PCR循环数为20的起始值。用20减18，那么两个样品有2个循环的差别或者说△Ct＝2。由于PCR反应指数式增长的本质，△Ct值要减2或者将差值乘4才能够将△Ct线形化。这种算法用于相对定量分析。 乙锭，而在于一些非特异的PCR产物同样被检测到而包含在被测的荧光信号值总量之