枯草杆菌感受态细胞的制备及转化.docVIP

枯草杆菌感受态细胞的制备及转化1)??将菌种接种在LB平板上37 培养过夜。2)??用接种环接一环菌苔于5mL GM I 溶液，在30 慢摇床（125 r/min）振荡培养过夜。3)??次日取2 mL转接到18 mL GM I 中，37 快摇床（250 r/min）培养3.5 h。4)??再取10 mL上一步骤的培养液转接到90 mL GM II 中，37 慢摇床培养90 min后5,000 g，10 min离心收集菌体。5)??用10 mL原培养液上清液轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞可以直接用来转化。6)??感受态细胞的保存：加30%的灭菌甘油至终浓度为10%，混匀后分装到离心管中（0.5 mL/tube），随即放到-70 保存。7)??转化时取出离心管，放在45 水浴中溶化，然后在0.5 mL菌液中加入适量DNA（～1 ug/ml）。8)??于37 振荡（200 r/min）保温30 min后涂布相应抗性平板，再在37 培养过夜，次日检查和验证转化子。枯草杆菌普通化学感受态细胞制备用试剂[1]??10×最低盐溶液：K2HPO4 70 g，KH2PO4 30 g，（NH4）2SO4 10 g，（Na3C6H5O7?2H2O）5 g，MgSO4?7H2O 1 g，在蒸馏水中依次溶解，加水至500 mL。[2]??氨基酸溶液（根据不同菌株的基因缺陷型准备）：10 mg/mL，贮于棕色瓶内，113灭菌30 min，用黑纸包裹。[3]??GM I溶液：1×最低盐溶液95.6 mL，20%葡萄糖2.5 mL，5%水解酪蛋白0.4 mL，10%酵母汁1 mL，10 mg/mL氨基酸溶液0.5 mL（50 μg/mL）。[4]??GM I溶液：1×最低盐溶液96.98 mL，20%葡萄糖2.5 mL，5%水解酪蛋白0.08 mL，10%酵母汁0.04 mL，1 M MgCl2 0.25 mL（2.5 mM），1 M CaCl2 0.05 mL（0.5 mM），10 mg/mL氨基酸溶液0.1 mL（5 μg/mL）。MOBITEC枯草芽孢杆菌载体表达系统? 北京毕特博生物技术有限责任公司 ? 联系人： ? 张钰 ? 电话： ? 010? 传真： ? 010 ? 电子邮箱： ? info@ ? 网址： ? ? QQ： ? ? 地址： ? 北京市海淀区北太平庄路 产品名称：?hp-Vector表达系统megaterium芽孢杆菌 试剂级别：?试剂级 产品产地：?德国 产品商标：?MOBITEC mobitec 产品：乳酸菌中NICE表达系统 2010-1-4 10:43:32 ????? 乳酸菌NICE系统是在乳链菌肽诱导下由nisA启动子控制目的基因表达的，含nisR和nisK的两组分调节系统的高效诱导表达系统。由于NICE系统的诱导剂、宿主菌和载体都是食品级的，其应用前景十分广阔。 产品特点: The system is fully food grade No endotoxins are produced No inclusion bodies No spores No extracellular proteinases Tightly controlled gene expression allows production of toxic proteins Simple fermentation, scale-up and down stream processing 应用领域： Production of homologous and heterologous proteins for food, feed, pharma and biocatalysis applications Production of prokaryotic and eukaryotic membrane proteins Production of exo-polysaccharides Production of ingredients through metabolic engineering: e.g. alanine, folate, diacetyl Preparation of L. lactis as a biocatalyst by expression of a suitable enzyme as e.g. dehydrogenases and in-situ co-factor regenearation High throughput