植物非细胞凋亡体系的构建.docVIP

植物非细胞凋亡体系的构建/qikan/periodical.articles/kxtb/kxtb99/kxtb9911/991112.htm 周　军　陈浩明　朱海珍　戴尧仁* (清华大学生物科学与技术系，北京 100084. *联系人) 摘要　为了研究植物细胞的凋亡机制，利用热激诱导凋亡的烟草细胞中的胞质溶胶，构建了植物非细胞凋亡体系.　温育在此体系中的正常烟草细胞核，出现染色质固缩、形成凋亡小体等典型的细胞凋亡的形态学特征，DNA电泳分析观察到核小体间DNA断裂所形成的梯状条带，将细胞核进行彗星电泳观测到彗星状的核DNA片段的迁移.　抑制剂研究发现，pepstatin A，leupeptin及EDTA均不能抑制上述形态学变化及生化变化，而iodoacetamide却能起到部分抑制作用，这与在动物细胞凋亡过程中发挥作用的Caspases的抑制模式十分吻合，表明与Caspases类似的半胱氨酸蛋白酶可能参与了植物细胞的凋亡过程.　关键词　细胞凋亡　非细胞体系　蛋白酶　蛋白酶抑制剂 　　细胞凋亡(apoptosis)是细胞在内外界刺激的作用下由基因调控的主动连续的程序化死亡过程.　凋亡在细胞的分化，生物体自稳平衡的维持及多种病理过程中具有重要作用，在动物中已经得到较为充分的研究［1，2］.　Lazebnik等人［3］和Nicholson等人［4］利用非细胞体系确定Caspase-3在哺乳动物细胞凋亡过程中起着关键性作用，并证明这类半胱氨酸蛋白酶的活化是细胞凋亡过程中的关键环节.　近年来，在植物中也发现了存在细胞凋亡的证据，并且与动物细胞的凋亡有许多共同特征［5，6］，但总的说来，植物细胞凋亡机制的研究目前尚处于起步阶段.　我们从热激诱导凋亡的烟草细胞［7］中提取胞质溶胶，加入正常的烟草细胞核，构建成植物非细胞凋亡体系.　蛋白酶抑制剂的研究表明，半胱氨酸蛋白酶可能参与植物细胞的凋亡过程. 1　材料与方法 　　()植物材料. 烟草(Nicotiana tabacum L.)悬浮细胞(品种为BY－2，诱导愈伤的外植体为子叶)接种于MS基本培养基(添加0.6 mg/L 2,4－D)，在25，120 r/min下振荡培养，每5 d传代1次.　　　() 热激处理. 将含有对数生长期的烟草悬浮细胞培养瓶置恒温水浴振荡器上，设置水浴温度为48，转速120 r/min，热激处理时间为1 h，然后再在25条件下继续培养24 h.　以25下培养的未处理细胞作对照.　　　() 胞质溶胶的提取. 主要参考Nicholson等人［4］的方法并做了改进.　先按照姜晓芳等人［8］的方法制备烟草原生质体，然后用冰冷的细胞裂解液（含40 mmol/L HEPES－KOH, 1.5 mmol/L MgCl\-2*6H\-2O, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L DTT, 0.1 mol/L sucrose）悬浮，在研钵中轻轻研磨，使质膜破碎但大部分细胞核保持完整.　在4下10 000×g离心10 min.　收集上清液，即为胞质溶胶，液氮速冻保存.　从热激处理的烟草细胞中提取的胞质溶胶用Cytosol*表示，对照组则用Cytosolo表示.　　　() 烟草细胞核的制备. 参考Saxena等人［9］的方法.　制备好的细胞核用核贮存液（10 mmol/L MES, 2.5 mmol/L sucrose, 1 mmol/L EDTA, 2.5 mmol/L DTT, 0.1 mmol/L spermidine, 10 mmol/L NaCl, 10 mmol/L KCl, 50% Glycerol）悬浮，计数后分装冻存于液氮中.　　　() 细胞核形态的观察. 每200 μL胞质溶胶中加入约2×106个细胞核（在研究抑制剂的影响时，胞质溶胶中预先分别加入1 μmol/L pepstatin A, 100 μmol/L leupeptin, 5 mmol/L EDTA, 5 mmol/L iodoacetamide），25下温育.　不同时间取样，用DAPI染色，在荧光显微镜下观察细胞核的形态变化；统计出现染色质固缩或形成凋亡小体等凋亡特征的细胞核数及总细胞核数，计算细胞核发生凋亡的百分率.　　　() 彗星电泳. 主要参考姜晓芳等人［8］的方法并作了改进.　将上述各样品和低凝聚点的琼脂糖溶液混合，均匀地铺在载玻片上.　待胶凝聚后，将玻片放入裂解液（30 mmol/L EDTA，0.2% SDS，pH=8.0）中5 min.　用清水和0.5×TBE缓冲液各漂洗1次，然后在恒压（3.0 V/cm）下电泳5 min.　用DAPI染色后，在荧光显微镜下观察结果.　　　() DNA的提取. 上述样品中各加入10倍体积DNA提取液（100 mmol/L Tris*H