唐琴微生物非培养技术技术总结.ppt

基因组研究概括 1990人类基因组计划启动 1994年美国启动了微生物基因组计划 2006春季人类元基因组计划 2006年8月人类肿瘤基因组计划 核心任务 遗传图、物理图、序列图。 通过遗传标记基因组作图（genome mapping）绘制每条染色体的遗传连锁图（genetic linkage map）和物理图（physical map）。 测序（sequencing）测定全基因组DNA分子的核苷酸排列次序。 中国在人类基因组计划中的成绩 建立了肿瘤、心血管疾病及神经、免疫、遗传性疾病的家系和疾病现场遗传材料的收集网络，取得了大量的样品。 建立了较完整的基因组研究技术体系。 疾病基因和功能基因研究获得实质性进展。 人类基因组遵循原则 1、全球化。 2、免费享用。 3、测序协作组遵循百慕大原则——所有大于2000个碱基对的序列都必须在24小时内递交到国际基因数据库中数据公开，资源共享。 人类基因组计划研究的发展趋势 第一，生命科学向纵深发展。 第二，对人类基因的认识才刚刚开始。（古希腊阿波罗神庙门槛上刻着认识自己，从遗传因子到基因组基本信息，基因组信息含义才开始起步） 第三，生物基因组已成为全球竞争新热点。 第四，基因图谱有助于进一步破译蛋白质。 第五，基因图谱有利于疾病诊断。 第六，后基因组时代序幕拉开。 宏基因组学通过直接从环境样品中提取全部微生物的 DNA,构建宏基因组文库,利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。 五、宏基因组学 为什么要研究宏基因组学呢？ 99%以上的微生物未 (难 )被纯培养, 对微生物世界的认识集中在不到1%的微生物上 人们对微生物的认识主要基于实验室纯培养的单一微生物物种,对微生物群落作为整体的功能的认识远远落后于对其个体的认识 环境基因组学的研究方法 以基因组学技术为依托 主要的程序包括: 1、从环境样品 (例如土壤 )中直接提取 DNA; 2、将 DNA克隆到合适的载体中; 3、将载体转化到宿主细菌建立环境基因组文库; 4、对得到的环境基因组文库进行分析和筛选。 由于环境基因组的高度复杂性 ,需要通过高通量和高灵敏度的方法来筛选和鉴定文库中的有用基因。 筛选技术大致可分为4类: 第 1类基于核酸序列差异分析 (序列驱动 )； 第 2类基于克隆子的特殊代谢活性 (功能驱动 )； 第 3类基于底物诱导基因的表达 ； 第 4类基于包括稳定性同位素和荧光原位杂交在内的其它技术。 序列分析法 鸟枪法测序 ( Shotgun sequencing) 将一条完整的目标序列随机打断成小的片段 ,分别测序 ,然后利用计算机根据序列间的重叠关系进行排序和重新组装, 并确定它们在基因组中的正确位置 。 优点：为筛选新的天然产物提供了一种可选择的途径, 从中挖掘上百万个新基因,揭示不可培养微生物的代谢途径. 缺点：耗费大,需大量人力和物力。与个体微生物基因相比,对序列片段进行分析则极为困难。 功能筛选法 方法一：对具有特殊功能的克隆子进行直接检测 ； 方法二：基于异源基因的宿主菌株与其突 变体在选择性条件下功能互补生长的特性进行。 以活性测定为基础 ,通过建立和优化合适的方法从基因组文库中获得具有特殊功能的克隆. 依赖于功能基因或编码功能蛋白在外源宿主中的表达 。 底物诱导基因表达法 代谢相关基因或酶基因往往在有底物存在的条件下才表达 ,反之则不表达 ,SIGEX即利用这个原理来筛选目的代谢基因。 第一步：以 p18GFP为载体构建宏基因组文库； 第二步：在无底物情况下以异丙基 —β2 D硫代半乳糖苷 ( IPTG)为诱导物去除阴性克隆和绿色荧光蛋白基因 ( gfp)表达的克隆子； 第