固定化胰蛋白酶到多功能中间大孔核壳微球一个新的快速酶催化平台技术总结.docVIP

胰蛋白酶固定到多功能介孔核壳微球：快速酶催化的新平台 摘 要 本研究通过将胰蛋白酶固定在多孔核壳Fe3O4 @ fTiO2微球上形成了一种简单、快速、有效和可重复使用的微波辅助胰蛋白酶消化系统。这种磁芯和二氧化钛壳纳米结构具有多种孔径（2.4和15 nm）（0.25cm3 g?1）（50.45 m2 g?1）（Cytc）β-乳球蛋白（β-LG）45s内被消化，并能通过质谱（MS）μL-1也可以测定。此外，45s微波辅助胰蛋白酶消化系统胰蛋白酶固定化微球重复使用5次后仍然有效10 μg小鼠脑蛋白的1715个特异蛋白质在经过45s微波辅助胰蛋白酶消化[1-3]。酶天然催化剂，质谱检测蛋白质的鉴定和翻译后修饰之前广泛应用于蛋白水解消化[4-6]。酶解是蛋白质组学中必要和关键一步，并且溶液和凝胶中蛋白质的水解是常用的蛋白质水解方法[7,8]。然而，通常由于劳动强度大，样品损失，酶的低稳定性，难回收，消化时间过长以及低浓度蛋白质的消化有限等使得酶解的应用受到限制[9-11]。因此，发展一种快速有效的蛋白水解方法实际生物医学蛋白质组分析非常重要[12]。随着纳米技术的迅速发展，各种纳米结构被开发用于载体以提高酶的稳定性和活性[13-17]。除了酶载体的组成，酶载体的结构在酶的固定化、酶活性和酶效率中也起着重要的作用[18,19]。特别是，大孔介孔材料能够作为有效的载体支载大量的酶，并能转运靶标生物分子[20-22]。尽管这些成果，许多现有的酶载体仍然有一些缺点。例如，由于酶分子缺乏的相互作用而降低酶的活性和效率繁琐复杂的作用[23]。[24]。对于高生产量的蛋白质组学来说，加速酶消化很迫切。因此，开发新型有效的酶固定化技术对于加速和方便蛋白水解至关重要。 磁性微粒具有较好的磁响应性，在水中分散性好，良好的生物相容性和化学稳定性的特点，它们已被广泛应用于各种生物分离过程中[25-27]。由于磁性核壳结构优良的特性和对多个离散组分之间产生的协同作用，它们吸引了大量的研究关注。最近，有研究证明，磁核和二氧化钛壳微球比纯Fe3O4粒子具有更强的微波吸收性能[28]。微波辐射可以加速蛋白质的酶解[29,30]，而TiO2材料基于其路易斯酸性质显示了对生物分子的高亲和力和高吸附能力[31-33]。因此，具有磁多孔二氧化钛壳核壳微球作为有效的酶固定化载体。应该指出的是，优化试验条件TiO2对磷酸肽的磷酸基团特殊的亲和作用，TiO2可以作为磷酸肽浓缩的有效亲和材料（pH下的三氟乙酸控（23）50-80%乙腈用于阻止与吸附剂的疏水相互作用）这表明TiO2在一个合适的pH值条件下（例如，弱碱性）非磷酸化生物分子（如蛋白质酶和肽）羧基螯合其他的相互作用（如氢键相互作用）更重要的是，TiO2生物分子亲和性可以通过使用不同实验条件（例如，溶剂和pH值）调节。因此，可以推断，合适的溶剂条件（例如，一个适当）TiO2可以与靶标生物分子的羧基产生螯合作用，从而将蛋白质酶和肽吸附。在此，我们报告胰蛋白酶花状核壳磁性微球（/大孔二氧化钛壳（记为））微波辅助胰蛋白酶消化平台（方案1） 通过TiO2壳的特异性亲和力Fe3O4的磁性和微波吸收性能结合，的胰蛋白酶消化平台具有几个（1）具有亲和力和高的比表面积，保证胰蛋白酶的高亲和力承载能力；（2）/大孔壳允许酶和蛋白质，促进反应物和产物多孔结构；（3）典型的胰蛋白酶消化快速磁分离条件坚固的结构帮助再生利用。 三氯化铁（FeCl3·6H2O），乙二醇（EG），异丙醇（IPA），二甲基甲酰胺（DMF）和氢氧化铵（NH3·H2O）北京化学试剂有限公司。钛酸四丁酯（TBOT），乙腈（ACN），碳酸氢铵（NH4HCO3），芥子酸（SA），25-二羟基苯甲酸（2,5-dhb）和二硫苏糖醇（DTT）均购自阿拉丁（上海，中国）。肌红蛋白（马心），细胞色素C（ty-c），β-乳球蛋白（β-LG），牛血清白蛋白（BSA）和胰蛋白酶（牛胰腺，TPCK处理）西格玛奥德里奇（St.路易斯，MO，USA）。碘乙酰胺（IAA）由（美国）提供。裂解缓冲是从Merck-Novagen?（达姆施塔特，德国）购买。所有的化学剂无需进一步纯化使用。 通常情况下，合成的颗粒（40）超声充分分散于DMF（10mL）和IPA（30mL）。然后，添加钛酸四丁酯（2mL）到上述分散超声5 min混合物转移到一个聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜（50mL）200℃加热10小时最后，产品乙醇冲，60℃干燥过夜，并在400℃煅烧2小时以除去残余的有机物质。 mg）分散在碳酸氢铵缓冲液（2mL，25mM碳酸氢铵水溶液，pH 7.8）中形成均匀的悬浮液。然后，添加Fe3O4 @ fTiO2微球（4mg）到悬浮液进行混合，4℃振摇30分钟，达到最大吸附。随后，借助磁铁分离和收集吸附胰蛋白酶的微