【预习】放免方法设计要点.ppt

添加剂 目的：改善试剂的稳定性/特殊需要 要求：对特异性结合无影响 常见添加剂 EDTA-Na2 ANS BSA/明胶 抑肽酶 叠氮钠/硫柳汞 反应体积 抗原抗体反应∝反应物浓度 减小反应体积，利于提高反应浓度，提高实验灵敏度 体积过小，易出现加样误差，形成放射性复合物的量亦减少，测量误差增加 常规选用反应体积为：0.3ml-1.2ml 温育条件 反应的平衡常数与温度相关 严格控制反应温度，包括整个分析至离心过程 测定指标不同，其对温度的依赖程度亦不同 温度与反应速度相关 提高反应温度，可加速反应，但亲和力下降 4℃抗体亲和力最大，但反应时间较长 目前多采用较短时间37℃或室温孵育 样品处理 样品中可能存在各种干扰物质，或影响特异性反应的物质。故许多分析系统需要对分析样品进行预处理，常用的预处理方法是稀释或提取。 反应方式的选择 反应方式 平衡法 顺序饱和法 即时法 反应方式 平衡法 Ab Ag Ag* 加入 分离剂 Ag* Ab Ag* 方法学评价 稳定、重复性好、剂量反应曲线具有竞争性分析的典型特征，灵敏度相对较低 反应方式 顺序饱和法(非平衡竞争体系) Ab Ag 平 衡 Ag* Ab Ag* Ag Ag* Ab 终止 反应 方法学评价 灵敏度较高，但因第二次孵育时间较短，要求标记抗原的比活性较高，并且要求分离方法更为精细。 因存在两次温育，曲线偏离典型特征，且反应稳定性较差。 反应方式 即时法 在反应尚未达完全平衡时终止反应，并进行分离测定。 要求：需严格控制反应时间。 分离方法的选择 分离系统 分离系统应依据实验要求选择。其对放射免疫分析的结果影响较大，分离不全或错分都可造成剂量反应曲线异常。 不同分离方法NSB差异较大，亦可影响反应的灵敏度，因此，选择适宜的分离系统更是建立放射免疫系统的重要步骤之一。 分离系统 常用的分离体系 125I 3H 双抗体-PEG/固相分离法 活性炭吸附法 方法学鉴定 方法学鉴定 剂量反应曲线稳定性检查 灵敏度检查 精密度检查 健全性检查 正常参考范围确定 临床有效性检查 方法学鉴定 剂量反应曲线稳定性检查 NSB/T B0/T 截距/斜率 ED PDP图 方法学鉴定 剂量反应曲线稳定性检查 灵敏度检查 精密度检查 健全性检查 正常参考范围确定 临床有效性检查 QC X SD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 L 3.31 0.25 3.20 3.52 3.56 3.11 3.28 2.50 3.0 3.40 3.52 3.0 M 10.5 1.25 11.7 10.6 11.5 11.1 10.3 9.60 10.6 9.80 7.90 8.70 H 30.8 2.71 29.8 26.2 32.1 34.2 31.5 32.1 28.7 31.6 24.9 26.2 样品 4.5 8.8 15.3 54.1 15.6 6.9 0.3 11.2 21.9 20.6 10.0 18.2 下面是某实验室10批内部质量控制的测量结果,根据这些数据绘制质控图并说明哪些不精密整批实验结果应舍弃,根据是什么? * * * Here comes your footer ? Page * 放射免疫分析方法的设计 放射免疫学 临床免疫教研室 李雪 前 言 原理 前 言 放射免疫方法的建立原则 根据分析目的和要求，通过对标记物、抗体、标准品（校准品）的合理匹配，以及对反应条件、分离方法的选择，达到最满意的效果 前 言 放射免疫设计的目标 根据要求使试剂的剂量反应曲线在满足灵敏度的情况下，是多数样品得到较高的精密度。 目录 灵敏度的设计 反应条件的选择 反应方式的选择 分离方法的选择 方法学鉴定 灵敏度的设计 灵敏度的设计 放射免疫分析的灵敏度 Sensitivity 指能测出的具有统计学意义的最小值，通常指“0”标准管结合率减两个标准差的相应剂量。 灵敏度的设计 放射免疫分析的灵敏度 Sensitivity 若以能测出的具有一定精密度的最小值为灵敏度的定义，则应根据剂量反应曲线的精密度图（PDP），以CV%-10%的最小剂量为有效地可测量的最小剂量，即灵敏度。 灵敏度的设计 放射免疫分析的灵敏度 Sensitivity 影响因素 标记物的比活性 抗体的亲和力和用量 剂量反应曲线浓度范围 标记物的用量 标记物的用量 ∝ 计数率 计数误差 灵敏度 统计涨落 样品保持 一定的计数率 ① 减少样品 化学量 ② 适当比活性、稳定的标记物 标记物的用量 最佳标记抗原的选择方法 用