cDNA文库构建例析.doc

cDNA文库构建 cDNA [原理]： cDNA文库不同于基因组文库，被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。CDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA开始，在此基础上，通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链，然后除掉mRNA，以第一条DNA链为模板复制出第二条DNA链（双链）；再进一步把此双链插入原核或真核载体。 ? ?????? cDNA文库的构建 分为六个阶段： 阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链 阶段2：cDNA第二链的合成 阶段3：cDNA的甲基化 阶段4：接头或衔接子的连接 阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA 阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接 ? [阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链] 1．在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成： poly(A)+RNA (1μg/μl) 10μl 寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl 1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl 1mol/L KCl 3.5μl 250 mmol/L MgCl2 2μl dNTP溶液（含4种dNTP，每种5mmol/L） 10μl 0.1 mol/L DTT 2μl RNase抑制剂（选用） 25单位 加H2O至 48μl 2．当所有反应组在0℃混合后，取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内。在这个小规模反应管中加入0.1μl [α-32P] dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）。 3．大规模和小规模反应管都在37℃温育1h。 4．温育接近结束时，在含有同位素的小规模反应管中加入1μl 0.25mol/L EDTA，然后将反应管转移到冰上。大规模反应管则在70℃温育10 min，然后转移至冰上。 5．参考《分子克隆实验指南》第三版附录8所述方法，测定0.5μl小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。此外，用合适的DNA分子质量参照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对小规模反应产物进行分析是值得的。 6．按下述方法计算cDNA第一链的合成量（推算方法略）： [掺入的活度值(cpm)/总活度值]×66(μg)=合成的cDNA第一链(μg) 7．尽可能快地进行cDNA合成的下一步骤。 ? [阶段2：cDNA第二链的合成] 1． 10 mmol/L MgCl2 70μl 2 mol/L Tris-HCl (pH7.4) 5μl 10 mCi/ml[α-32P] dCTP（400 Ci/mmol） 10μl 1 mol/L (NH4)2SO4 1.5μl RNase H (1000单位/ml) 1μl 大肠杆菌DNA聚合酶I (10 000单位/ml) 4.5μl 温和振荡将上述试剂混合，在微量离心机稍离心，以除去所有气泡。在16℃温育2~4h。 2． β-NAD (50 mmol/L) 1μl 大肠杆菌DNA连接酶(1000~4000单位/ml) 1μl 室温温育15min。 3．1μl含有4种dNTP的混合物和2μl T4噬菌体DNA聚合酶。反应混合物室温温育15分钟。 4．3μl反应物，按步骤7和8描述的方法测定第二链DNA的质量。 5．5μl 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)加入剩余的反应物中，用酚：氯仿和氯仿分别抽提混合物一次。在0.3 mol/L(pH5.2)乙酸钠存在下，通过乙醇沉淀回收DNA，将DNA溶解在90μl TE(pH7.6)溶液中。 6．DNA溶液中： 10×T4多核苷酸激酶缓冲液 10μl T4多核苷酸激酶（3000单位/ml） 1μl 室温温育1