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分子生物学常用技术 第十七章 分子生物学常用技术 凝胶电泳 分子杂交 聚合酶链反应(PCR)技术 DNA的物理图谱 DNA序列测定 基因芯片 第一节 凝胶电泳(gel electrophoresis) 电泳概念 基本原理 Q μ＝ 6πrη μ: 迁移率 Q : 电荷量 r : 粒子半径（分子量） η: 介质粘度 电泳的用途 分离 鉴定纯度 测定分子量 凝胶电泳的种类 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis) 分离核酸原理 操作要点 应用范围 （一）分离核酸原理 电荷效应 分子筛效应 分子构象 1. 电荷效应 核酸是两性电解质 pH = 3.5 , 正电荷 pH = 8.0~8.3 , 负电荷，正极 2.分子筛效应 小分子移动快 ，大分子移动慢 3. 分子构象 闭环超螺旋线状DNA开环DNA （二）操作要点 支持物 凝胶浓度的选择 DNA分子量标准 电泳缓冲液 样品制备 电泳条件 DNA电泳染色 DNA片段的回收 1. 支持物 商品化的琼脂糖 琼脂糖种类 2. 凝胶浓度的选择 凝胶的制备 3. DNA marker DNA marker DNA 长度标准曲线 4. 电泳缓冲液 Tris-乙酸(TAE)pH 8.0 Tris-硼酸(TBE) pH 8.0 Tris-磷酸(TPE) pH 8.0 5. 样品制备 上样缓冲液 50%甘油/蔗糖 0.5%溴酚蓝/二甲苯青 点 样 6.电泳条件 潜水电泳 恒压电泳 低压: 1~2V/cm 中压: 8~10V/cm 高压电泳：几十V/cm 温度：15~25℃ 潜水电泳 7.电泳染色 溴乙锭(ethidium bromide, EB) 结构及染色原理 染色方法 加入凝胶液中 电泳结束后染色 EB染色原理 紫外灯下显色 8. DNA片段的回收 低熔点琼脂糖法 透析袋电洗脱法(5kb) DEAE-纤维素膜法(0.5~5kb) （三）应用范围 DNA的分离、纯化和鉴定 限制性酶切图谱分析 重组体的分离、鉴定 杂交分析 PCR产物的分离鉴定 琼脂糖凝胶电泳 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) 分离原理 操作要点 优点 应用范围 （一）分离原理 电荷效应 分子筛效应 PAGE支持物 单体－丙烯酰胺(Acr) 交联剂－甲叉双丙烯酰胺(Bis) 催化剂－过硫酸胺(AP) 加速剂－N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED) （二）操作要点 凝胶的分类 凝胶浓度的选择 凝胶液的配制 凝胶中DNA的检测 DNA片段的回收 1. 凝胶的分类 非变性凝胶：dsDNA 变性凝胶: ssDNA 尿素 甲酰胺 SDS 2. 凝胶浓度的选择 3. 凝胶液的配制 PAGE装置 电 泳 4. 凝胶中DNA的检测 溴乙锭染色法 银盐染色法 甲醛 还原 放射自显影法 5.DNA片段的回收 压碎浸泡法 1kb 纯度高，回收率低 （三）PAGE优点 机械强度好、化学稳定性高 分辨率高 载样量大 回收的DNA纯度高 （四）PAGE应用范围 分离、纯化和鉴定RNA和小分子DNA DNA序列分析 PCR产物鉴定 蛋白质的检测和分析 第二节 分子杂交 分子杂交的基本原理 固相支持物 探针 几种常用杂交技术 一、分子杂交的基本原理 核酸的变性和复性 杂交条件 靶分子 探针 杂交袋 杂交炉 杂交种类 被检核酸种类和方法 原位杂交 斑点杂交 Southern杂交 Northern杂交 Western杂交 反应介质 液相杂交 固相杂交(?) 二、固相支持物 固相支持物的特性 结合能力强 不影响杂交反应 结合牢固 非特异性吸附少 机械性能良好 固相支持物的种类 硝酸纤维素滤膜 (nitrocellulose filter membrane) 尼龙膜(nylon membrane) 1.硝酸纤维素滤膜 特点 吸附ssDNA和RNA 杂交信号本底低 不足 不适于重复杂交 滤膜较脆 不适于电转移印迹法 对DNA小片段(200bp)结合能力弱