余功臣(分子克隆)余功臣(分子克隆).doc

分子克隆技术实验报告 应用生物技术0801 2008304201308 余功臣 2011年5月22日 说明 实验是由小组成员集体完成，实验报告以及结果分析由个人完成。小组成员：余功臣、晏星、何一鸣、伍良伟。试验时间由2011年5月8日至5月14日，共完成分子克隆、分子杂交和基因表达检测三大部分的实验。下列实验报告中的实验试剂具体成分以及配置方式均未列出，详见《分子克隆技术实验手册》附录。 一．将M812载体上的水稻DNA片段亚克隆于pUC19载体上 摘要 运用碱裂解法抽提质粒载体pUC19和带有水稻目的DNA片段M812的质粒pU1301，用琼脂糖凝胶电泳检测所提取的质粒DNA的质量，用限制性内切酶BamI和KpnI处理pU1301和pUC19，将纯化的载体pUC19与回收的水稻DNA 片段M812连接后，将重组的DNA分子导入感受态细胞大肠杆菌菌株DH5(并在培养皿上培养。 关键词 碱裂法 琼脂糖凝胶电泳检测 亚克隆 感受态细胞 重组子的转化 1 前言 亚克隆，即是将已经获得的目的片段进行进一步分析，或者进行重组改造等过程。其基本过程包括：（1）目的片段和载体的制备；（2）目的片段和载体的连接；（3）连接产物的转化；（4）重组子筛选。 本实验中的目的片段和载体均来自细菌质粒，因此细菌质粒的抽提是目的片段和载体制备的核心步骤。本实验中以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。碱裂解法，是1979年由Birnboim和Doly设计并发表的经典质粒DNA提取方法。其核心原理是在碱性条件下线状DNA发生变性，质粒DNA维持环状。在高盐条件下作复性处理，变性的染色体会沉淀，从而将质粒DNA与染色体DNA分开。 在pH值为8.0－8.3时，核酸分子带负电，在电泳时由负极向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。所抽提的质粒即用电琼脂糖凝胶电泳来检测。一般所抽提的质粒在琼脂糖胶上能够呈现三条带，因为质粒有三种构型，即线状、环状、开环状。 将所获得的载体质粒与带有目标片段的质粒进行重组，其包括载体及外源DNA片段的双酶切消化、目的片段的回收和载体的纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DNA片段的克隆技术是分子操作的核心部分。 将重组DNA导入大肠杆菌细胞一般有两种方法——CaCl2法和电转化法，本实验中采用CaCl2法。 本实验采用CaCl2法制备感受态细胞：利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106 ～ 107转化子/(g DNA。 2 材料和方法 2.1用碱裂解法抽提质粒 2.1.1实验材料 2.1.1.1菌液 携带pUC19质粒载体的大肠杆菌菌液 携带含有水稻DNA片段的pU1301载体的大肠杆菌菌液。 2.1.1.2培养基 携带pUC19质粒载体的大肠杆菌和携带含有水稻DNA片段的pU1301载体的大肠杆菌的培养先采用含相应抗生素的LA培养基，后采用LB培养基。大肠杆菌菌株DH5(采用LB培养基。大肠杆菌在37℃培养。抗生素的使用浓度：氨苄青霉素，100μg/ml；卡那霉素，50μg/ml。 2.1.1.3实验试剂 Solution I; SolutionII; SolutionIII; 苯酚/氯仿; 异丙醇;ddH2O2 2.1.2两种载体的抽提步骤 1. 取含有所需载体的大肠杆菌菌液于含有相应抗生素的LA培养基上涂布或划线分离单菌落，37℃过夜培养； 2. 用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中，37℃摇床~250 r/min过夜培养； 吸取1.5ml菌液，12000r/min离心1分钟，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次12000r/min离心1分钟收集菌体，尽量将菌液倒干净； 加入300(l 溶液 I，振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）； 加入300(l 溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟（最好不超过2分钟）； 加入300(l 溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀； 12000 g离心10分钟； 吸取800(l 上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟； 12000 g 常温离心15分钟； 倒尽上清，加500 (l 75％乙醇浸洗除盐，（放置片刻