冷冻技术基本原理.doc

冷冻技术基本原理 生殖医学中的冷冻技术是将配子或胚胎从生理温度降至低温并贮存，需要时解冻复苏进行体外受精或胚胎移植。为增加配子和胚胎冻融的存活率，必须选择合适的冷冻保护剂和采用适宜的降温速度。 (一)冷冻对细胞的损伤 处于分裂中期的细胞对温度变化导致的损害特别敏感，这些损害包括纺锤体的缩减、染色体边界不稳定、透明带产生裂缝并变硬、皮质异常反应、细胞骨架损害、细胞内各种酶和分子结构的改变等。冷冻保存时，由于细胞内外水分形成冰晶，致使细胞受到机械的、化学的和渗透压的影响而遭到破坏。冷冻对细胞造成的损伤主要有：①在外界机械物理刺激下诱发冰晶形成的温度称为冰点。当外界温度达到冰点时，首先在细胞外液形成冰晶，随着温度的进一步下降，细胞外液溶质浓度升高，导致细胞内水分不断外渗。②冷冻时如果降温速度过慢，细胞脱水收缩引起细胞内原生质和细胞器的变化从而造成不可逆的损伤。③当降温速度过快时，细胞外溶液形成大量冰晶，细胞内水分来不及渗出，在细胞内形成冰晶，称为机械效应。此时细胞内超微结构会遭到破坏。④由于从液态变为固态，细胞质膨胀率、收缩率不同形成断面，造成细胞质破裂损伤。⑤在复温洗脱出冷冻保护剂时，由于经冷冻后细胞膜的渗透率的变化，造成渗透性损伤。 (二)冷冻保护剂 冷冻保存细胞的新陈代谢已经完全停止，细胞冷冻后能否存活取决于细胞在冷冻和复苏过程中能否适应各种物化的、生理的、生化的改变。使用冷冻保护剂，采用适宜的冷冻和解冻操作程序可以避免冷冻时细胞遭受损伤，从而达到长期低温保存的目的。 1.渗透性保护剂：是一类能渗透入细胞的低分子化合物，这类物质与水结合后黏滞性显著增高，使结晶过程延缓；增加盐类溶剂的容积，使盐溶液不致升高到中毒的水平；抑制冷冻过程中，特别是缓慢冷却和复温时出现的渗透压效应。目前常用的有丙二醇(propanediol，PROH)、二甲基亚砜(dimethylsulphoxide，DMSO)、甘油(glycerol)、乙二醇(ethyleneglycol)等。 2.非渗透性保护剂：是一类能溶于水，但是不能渗透入细胞的大分子物质。它能增高细胞外溶液的渗透压起到非特异性保护作用，使细胞在冷冻程序以前脱水。慢速冷冻时，可以降低细胞外溶液的溶质浓度，减少了阳离子进入细胞的数量；快速冷冻时，由于细胞内水分已经部分渗出，减少了细胞内的冰晶形成。目前常用的非渗透性冷冻保护剂有蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖等。 (三)冷冻保护剂的作用机制 细胞冷冻的两个关键问题，其一是使用冷冻保护剂，使细胞充分脱水以防止细胞内冰晶形成而造成损伤；其二是选择适宜的降温梯度减少对细胞的损伤。 1.避免细胞内冰晶形成：细胞冷冻的一个重要过程是脱水，在投入液氮前使细胞充分脱水，避免形成细胞内结晶，是细胞冻融后能够存活的主要因素。将胚胎放入保护剂中，胚胎的变化首先是细胞外的高渗溶液引起的细胞皱缩，然后随着渗透性保护剂进入细胞内，细胞再次膨胀，冷冻保护剂和细胞内水分置换，减少细胞内冰晶形成，细胞脱水和保护剂渗入细胞两者之间的平衡对冷冻成功非常重要，它受到保护剂的浓度、平衡时的温度和停留时间、细胞膜稳定性的影响。 慢速冷冻过程中在-5～-7℃时必须人工诱导麦管内液体形成结晶，又称“植冰”。细胞外液体结晶后，导致细胞内水分向细胞外渗透，在以后缓慢的降温过程中，细胞充分脱水，然后快速降温直至浸入液氮。如果不进行植冰或者植冰不充分，胚胎将会由于脱水不完全在细胞内形成冰晶而遭受损害。 2.避免渗透性休克：冻存胚胎刚解冻时，细胞内所含的渗透性保护剂浓度非常高，可以达到2000～3000mOsm/L或更高，若此时直接将胚胎置于渗透压为285mOsm/L的培养液中，由于大量水分快速进入细胞而保护剂不能立即渗出导致细胞急剧肿胀甚至破裂，这种现象称为渗透性休克。采用梯度稀释法逐步将冷冻保护剂从细胞中置换出来，可以避免渗透性休克的发生。将胚胎放入非渗透性保护剂形成的渗透压缓冲液中，细胞内保护剂逐步渗出，就不会因细胞内含大量渗透性保护剂而吸入大量水分。 3.避免解冻过程中冰晶重新形成：解冻过程中如果水分进入胞浆后在原有小冰晶的周围形成更大的冰晶，可以造成细胞的损害，控制解冻的速度可以避免再结晶。细胞内冰晶重新形成的温度为-85～-70℃，所以从液氮中取出冷冻管后，先在空气中摇动30～40秒，当其温度接近-80℃时，要将冷冻管立即置于30℃水浴中快速升温，避开再结晶温度。 (四)常用的冷冻方法 1.慢速冷冻、快速或慢速复温法：慢速冷冻—快速复温法是最常用的方法。将细胞放在含有冷冻保护剂的溶液中处理，然后利用程序降温仪缓慢降温，采用人工植冰的方法使细胞充分脱水，继续降温后达到一定温