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cDNA文库的构建 (2009-10-14 13:43:26) 转载 标签： 分类： ? cDNA文库的构建基因文库的构建是现代生命科学研究中的一项重要技术。自70年代初首例cDNA克隆问世以来，已用构建和筛选cDNA文库的方法克隆了很多基因。通过构建cDNA文库能直接分离到生命活动过程中的一些调控基因及了解这些基因所编码的蛋白质的相互作用关系．因此cDNA文库的构建是基因克隆的重要方法之一，从cDNA文库中可以筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。它是发现新基因和研究基因功能的工具。1.cDNA文库构建的原理真核生物基因的结构和表达控制元件与原核生物有很大的不同。真核生物的基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经RNA转录后加工过程才使编码序列拼接在一起。真核生物的基因不能直接在原核生物中表达，只有将加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA（complementary DNA,cDNA）接上原核生物表达控制元件，才能在原核生物中表达。而且，真核细胞的基因通常只有一小部分进行表达，由于mRNA的不稳定性，对基因表达和有关mRNA都常通过对其cDNA来进行研究。为分离cDNA克隆或研究细胞的cDNA谱，需要先构建cDNA文库。所谓cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。cDNA文库应包含的克隆数目可由以下公式来计算：N=ln(1-p)/ln(1-1/n)式中：N－cDNA文库所包含的克隆数目；P－低丰度cDNA存在于库中的概率，通常要求其大于99％；1/n－每一种低丰度mRNA占总mRNA的分数。2.构建cDNA文库的基本步骤构建cDNA文库的基本步骤有五步：①制备mRNA；②合成cDNA；③制备载体DNA；④双链cDN的分子克隆；⑤对构建的cDNA文库进行鉴定，测定文库包含的克隆数，抽查克隆的质量和异质性，如果需要可适当扩增。对cDNA的文库的要求：一是希望文库能包括各种稀有mRNA的cDNA克隆；二是克隆的cDNA应是全长的，避免丢掉5’端的序列。2.1mRNA的分离制备构建cDNA文库质量好坏的关键是制得高质量的mRNA。无处不在的mRNA酶极易降解mRNA，在mRNA的操作过程中自始至终都必须防止RNA酶的降解作用。①所有用于mRNA的实验的器皿都要高温焙烤或是用0.1％焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）洗涤，所有试剂都要用DEPC处理过的水配制，DEPC是RNA酶的强变性剂，经煮沸DEPC即分解除去，避免残留物影响mRNA的实验；②在破碎细胞的同时用强变性剂（如酚、胍盐等）使RNA酶失活；③在mRNA反应中加RNA酶的抑制剂Rnasin。目前实验室中提取细胞总RNA的方法主要有：胍盐/氯化铯密度梯度超速离心法和酸性胍/酚/氯仿抽提法。前一方法常用于大量制备RNA；后一方法用于一般小量制备RNA，因此更为常用。真核生物的mRNA 3’端通常都含有寡腺苷酸〔poly(A)〕,可以用寡聚胸苷酸〔oligo(dT)〕纤维素或琼脂糖亲和层析法来分离纯化。在高盐缓冲溶液中poly(A)＋RNA与oligo(dT)结合，低盐缓冲溶液使它们解离。2.2cDNA的合成合成cDNA的逆转录酶有两种，一种来自禽成髓细胞性白血病病毒（avian myeloblastosis virus,AMV），另一种来自莫洛尼鼠白血病病毒（Moloney murine virus,M-MuLV）。逆转录酶为多功能酶，它能以RNA链为模板合成第一条cDNA链，并具有RNase H 活性，水解杂合分子中的RNA链，再以第一条cDNA链为模板合成第二条cDNA链。逆转录酶以4dNTP为底物，合成cDNA时需要引物，无校对功能。AMV逆转录酶反应的最适温度为42℃，最适pH8.3，并且具有较强的RNase H活性。M-MuLV逆转录酶由一条多肽链构成，反应最适温度为37℃，最适pH7.6，具有较弱的RNase H活性。第一条cDNA链的合成常用的引物为oligo(dT)12－18，或是六核苷酸的随机引物（dN）6，如果序列是已知的，也可以用与mRNA3’端序列互补的引物。杂合分子中的RNA链用RNase H或碱溶液水解除去。第二条cDNA链可用以下方法合成：①回折法，利用第一条cDNA链自身回折来引发第二条链的合成，双链合成后用核酸酶S1(nuclease S1)切去回折处的单链DNA。这一步操作常使cDNA失去5’端的部分序列，因此现在较少使用。②取代法，用RNase H部分水解DNA-RNA杂合分子中的RNA链，留下一些小片段RNA作为合成cDNA第二条链的引物，除加入DNA聚合酶Ⅰ和4种dNTP底物