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脂代谢相关基因siRNA沉默的实验步骤 第一部分：siRNA转染条件的优化及靶点筛选。 写文章所需要的数据： 1. 三对siRNA序列； 2. 转染效率及图片； 3. 对mRNA的抑制率及图片（非常重要） 4. 对蛋白质的抑制率及图片（非常重要） 实验步骤： 1. 准备工作 （1）培养瓶、玻璃吸管和枪头消毒；分装培养液、青霉素-链霉素和胰酶的管子消毒及分装；PBS配置及消毒。 （2）培养液分装100ml/瓶，使用100ml玻璃瓶分装；青霉素-链霉素分装1ml/管，使用冻存管分装；胰酶分装1ml/管，使用冻存管分装。 （3）培养液的配置，每100ml细胞培养液（美国Hyclone）中加入10ml血清（成都哈里生物）和1ml青霉素（10000U/mL）-链霉素（10000ug/mL）（美国Hyclone）。 2. HepG2细胞复苏 （1）从液氮中取出冻存管，直接浸入37温中，并不时摇动其尽快融化。取出冻存管打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀00rpm离心5min。 （4）弃去上清液，加入培养液重悬细胞，接种培养瓶，次日更换培养液一次，继续培养。uM/L的储存液。 ① 25nmol/L siRNA×1.5ul/孔：不含血清不含抗生素的DMEM培养液150ul置于消毒EP管中；加入转染试剂4.5ul，移液枪反复轻轻吹打混匀；加入阴性对照siRNA储存液1.2ul，移液枪反复轻轻吹打混匀；室温下放置20min形成转染复合物；加入750ul无血清的培养液，处理时每孔加入50ul即可。 ② 25nmol/L siRNA×3.0ul/孔：不含血清不含抗生素的DMEM培养液150ul置于消毒EP管中；加入转染试剂9.0ul，移液枪反复轻轻吹打混匀；加入阴性对照siRNA储存液1.2ul，移液枪反复轻轻吹打混匀；室温下放置20min形成转染复合物；处理时每孔加入50ul即可。 ③ 50nmol/L siRNA×1.5ul/孔：不含血清不含抗生素的DMEM培养液150ul置于消毒EP管中；加入转染试剂4.5ul，移液枪反复轻轻吹打混匀；加入阴性对照siRNA储存液2.3ul，移液枪反复轻轻吹打混匀；室温下放置20min形成转染复合物；处理时每孔加入50ul即可。 ④ 50nmol/L siRNA×3.0ul/孔：不含血清不含抗生素的DMEM培养液150ul置于消毒EP管中；加入转染试剂9.0ul，移液枪反复轻轻吹打混匀；加入阴性对照siRNA储存液2.3ul，移液枪反复轻轻吹打混匀；室温下放置20min形成转染复合物；处理时每孔加入50ul即可。 ⑤ 75nmol/L siRNA×1.5ul/孔：不含血清不含抗生素的DMEM培养液150ul置于消毒EP管中；加入转染试剂4.5ul，移液枪反复轻轻吹打混匀；加入阴性对照siRNA储存液3.4ul，移液枪反复轻轻吹打混匀；室温下放置20min形成转染复合物；处理时每孔加入50ul即可。 ⑥ 75nmol/L siRNA×3.0ul/孔：不含血清不含抗生素的DMEM培养液150ul置于消毒EP管中；加入转染试剂9.0ul，移液枪反复轻轻吹打混匀；加入阴性对照siRNA储存液3.4ul，移液枪反复轻轻吹打混匀；室温下放置20min形成转染复合物；处理时每孔加入50ul即可。 （4）阴性对照siRNA转染HepG2细胞。若细胞状态良好，可以进行转染实验，否则重新培养细胞。细胞密度长至60%-80%时，换液，将配制的各种处理液滴加到各个处理孔中。滴加完毕，前后轻轻移动培养板使处理液均匀分布。置于培养箱中处理6-24h，荧光显微镜下拍照计数。 （5）转染率的计算。在荧光显微镜下，每人、每孔随机选取1个视野，计数荧光细胞数和总细胞数，计算转染率（转染率=荧光细胞数/总细胞数×100%）。 4. siRNA有效靶点的筛选 （1）HepG2细胞六孔板培养。取6张六孔板，编号1-6号，1、3和5号用于mRNA的检测，2、4和6号用于蛋白质的检测。共7个处理【3对siRNA+阴性对照（Negative control, NC）+转染试剂对照（Mock transfection, MT，用于检测转染试剂是否影响靶基因的表达量）+空白对照（Blank control, BC，不做任何处理，用于检测HepG2细胞中靶基因的本底表达）】+阳性对照（Positive control, PC，用于验证实验操作的正确性）。每个处理设2次重复。将消化并稀释好的细胞均匀接种于六孔板中（2-6×105/孔），每孔接种2ml。细胞密度长至60%-80%时，进行转染。 （2）siRNA转染复合物的配制。按照转染率最高的siRNA浓度进行配制。 三对siRNA的配置方法： 阴性对照的配制方法： 转