生物传感器大肠杆菌砷探测器制作工艺要点.pptVIP

生物技术1302 梁竟一 微生物传感 大肠杆菌 砷探测器 微生物研讨 原理回顾 砷探测器的设计原理 设计原理：大肠杆菌砷探测器 大肠杆菌的质粒R773中有一个抗砷操纵子,编码了两个阻遏蛋白质ArsR和ArsD,分别对低和高浓度砷或亚砷酸盐敏感。该基因线路利用了这两个蛋白质,用ArsR和ArsD分别控制基因和lacZ基因的表达,而λcI和lacZ基因一起控制尿素酶基因的表达。 原理回顾 大肠杆菌砷探测器作用机制 中性 在有低浓砷或亚砷酸盐时(约5PPb),其与ArsR结合形成复合体从而解除了对I基因的阻遏,表达生成的几Cl又阻遏了尿素酶基因的表达,使培养液呈中性。 酸性 当有高浓度砷或亚砷酸盐时(约20ppb),其与ArsD结合从而解除了对lacZ基因的抑制,表达生成的半乳糖昔酶催化半乳糖降解使之生成乙酸和乳酸,使培养液呈酸性,pH值可达5以下。 碱性 在没有砷(亚砷)酸盐时,λcI基因不表达,通过加人异乳糖解除lacI的阻遏后尿素酶基因表达,催化底物尿素产生氨使培养液呈碱性(pH值达到9以上)。 第一部分 样液的培育 1）使用细胞工程，培养大肠杆菌，使用细胞工程,培养大肠杆菌,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒R773,质粒为环状.。 2）选取大肠杆菌质粒R773，同时用ArsD和ArsR对λcI和LacZ进行编码。 3）编辑好之后将质粒送回大肠杆菌:：在大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质,如CaCl2,这使细胞会吸收外源基因。 4）此时将重组的质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒吸收。这样既可得到所需大肠杆菌样液。 第二部分 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 1）.牛肉膏蛋白胨固体培养基配方（即计算） 物质：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、水。重量：5g、10g、5g、20g定溶至1000mL 2）.称量 按比例称取各种物质，注意事项：牛肉膏要放在称量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。 3）.溶化：先将牛肉膏连同称量纸一起放入烧杯，加少量水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌使之溶解，再加入琼脂，搅拌，待溶解后，加自来水定溶至100mL。 4）.灭菌：将配制好的培养基放到锥形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮纸），连同培养皿（3～5套，用几层报纸包好）一起放到高压锅内灭菌。 5）.倒平板：待培养基冷却到50OC左右时倒平板。 实 验 室 培 养 第二部分 纯化大肠杆菌 实 验 室 培 养 平板划线法 通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集 的菌种逐步稀释分到培养基的表面在数次划线后可以分离到 由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体称菌落。 第三部分 大肠杆菌生长特点 最适生长温度为37℃,在42-44℃条件下仍能生长,生长温度范围为15-46℃.在普通营养琼脂上生长表现3种菌落形态： ： （1）光滑型： 菌落边缘整齐,表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色,在生理盐水中散. （2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐,易在生理盐水中自凝 . （3）粘液型：常为含有荚膜的菌株. 此菌兼性厌氧,在有氧条件下生长良好,最适生长pH为6.8-8.0,所用培养基pH为7.0-7.5,若pH值低于6.0或高于8.0则生长缓慢. 培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同。随着时间的延长、菌落的不断生长，使菌落不断增大。 第四部分 工业批量生产 1） 刮下筛选好的大肠杆菌菌落，至三角瓶中（三角瓶中有预先配好的适合大肠杆菌生长的融化的牛肉高蛋白胨培养基）摇匀，八层纱布包扎。 2）确定最佳操作条件 3）转移至大型发酵罐进一步培养。 第五部分 后期工艺处理 将培养出的大肠杆菌液进行工厂加工，这里设想为9.5ml大肠杆菌液与0.5ml酚酞液（这里考虑最佳配比）混匀后装入透明钠钙玻璃管制液体瓶，（大口外径一般为15mm，小口外径为13mm，瓶高61.5mm，通常配套橡胶塞和13mm或者15mm铝塑组合盖）中。 第六部分 原料成本经济效益预算 摇瓶机 20900 购买链接 /offer/43271094098.html?tracelog=p4p 真空烘箱 3900 购买链接 /offer/43271094098.html?tracelog=p4p