[常规真核表达与鉴定.ppt

* 常规真核表达与鉴定 ——刘宗梁 2013-10-19 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. * 一、真核表达概述； 二、常用真核表达系统； 三、细胞与载体的选择； 四、哺乳动物细胞转染； 五、Western-blot法对转染结果的检测； 六、间接免疫荧光法（IFA）对转染结果的检测； 七、Cell-ELISA法对转染结果的检测； 主要内容： Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. * 一、真核表达概述 1、真核表达：通过将外源基因克隆到真核表达载体，并转染到合适的真核细胞中，最终获得外源目的基因高效表达产物的过程。 2、真核表达相对原核表达的优点：在真核表达的过程中，可以通过真核细胞的转录及修饰系统（如甲基化修饰、糖基化修饰、乙酰化修饰等）获得具有一定构象和生物活性的蛋白质；表达目的蛋白更的结构及生物学功能（如免疫原性等）更接近于该蛋白的天然状态，且表达的蛋白不存在原核表达中“包涵体”这一现象。 3、真核表达缺点：表达量低，一般难以持久表达。 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. * 二、常用真核表达系统 1、毕赤酵母表达体系：酵母细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但纯化难度大。 2、慢病毒表达系统：商品化的慢病毒表达系统（如Lenti-X）在病毒包装时获得VSV-G泛嗜性重组慢病毒，通过膜质偶联和膜质融合的方式感染靶细胞，可感染几乎所有类型的哺乳动物细胞。 3、哺乳动物细胞表达体系：对蛋白的加工与修饰与酵母及昆虫表达系统完全不同，可通过脂质体等直接将外源表达质粒导入哺乳动物细胞，进行表达。哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白，但其表达量低。 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. * 4、杆状病毒昆虫细胞表达体系：蛋白表达水平高，可长晶体，多用于蛋白结果与功能的研究，但重组质粒构建及融合十分复杂。 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. * 三、细胞与载体的选择 1、常用于表达的哺乳动物细胞：COS-7、BHK、293T、Sf-9、Sf-21等，具体选择可根据实际需要或者表达载体所含的表达原件等进行选择。 2、表达质粒的选择：常用的真核表达质粒有pCAGGS、pCDNA