抗体制备研究生.ppt

抗体制备技术 抗体技术的发展 多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）：用一种包含多种抗原表位的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体. 单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体。 基因工程抗体（genetic engineering antibody）： 应用DNA重组及蛋白工程技术对编码抗体的基因按不同需求进行改造和装配，经导入适宜的受体细胞后重新表达的抗体。 抗体制备技术 一、多克隆抗体制备 （一）免疫原的制备 （二）免疫动物 （三）免疫血清的纯化 （四）免疫血清的鉴定 （五）免疫血清的 二、单克隆抗体制备 （一）单克隆抗体制备原理 抗体制备技术 （二）单克隆抗体制备的技术要点 （三）影响杂交瘤技术的因素 （四）单克隆抗体的应用 三、基因工程抗体技术 （一）人源化抗体 （二）小分子抗体 （三）双特异性抗体 （四）抗体库技术 一、多克隆抗体制备 （一）免疫原的制备 免疫原（immunogen）指能刺激机体免疫系 统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最 重要的性质是免疫原性（immunogenicity） 免疫原—天然抗原、人工或合成抗原； 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原； 具体制备—细胞性抗原、可溶性抗原、半抗 原和免疫佐剂～ 1、颗粒性抗原制备： 颗粒性抗原主要是指细胞抗原、细菌抗原和寄生虫体抗原。 绵羊红细胞（SRBC）- 溶血素； 细菌- 抗菌抗体（动物免疫血清） 2、可溶性抗原制备： 蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸等都是良好的可溶性抗原，成分比较复杂，来源于人和动物的组织和细胞，通常需要将组织或细胞破碎，再经一定的方法提取和纯化。 细胞破碎技术： 酶处理法 冻融法 超声破碎法 表面活性剂处理 常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等 方法：在一定的条件下，能消化细菌和组织细胞。 特点：①此法适用多种微生物； ②作用条件温和； ③内含物成分不易受到破坏； ④细胞壁损坏的程度可以控制。 原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。 方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然后缓慢融化，如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可被融破。 特点：此法适用于组织细胞，对微生物细胞作用较差。 原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎。由于超声波发生空化作用（cavitation）使得液体形成局部减压引起液体内部发生流动，漩涡生成与消失时，产生很大的压力，使细胞破碎。超声波使用的频率从1kHz～20kHz不等，间歇进行，避免长期超声产热，导致抗原破坏。 特点：①操作简单，重复性较好，节省时间； ②多用于微生物和组织细胞的破碎。 原理：在适当的温度、pH及低离子强度的条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。 常用的有：十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子型)、二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯（非离子型）、新洁尔灭等。 应用：①破碎细菌，且作用比较温和； ②提取核酸时，常用此法破碎细胞。 可溶性抗原的提取 ①超速离心分离—是一种根据分离物质的比重特点，通过差速或梯度密度离心，将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法，只适宜少数大分子物质的分离。 ②选择性沉淀—选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或利用某些条件促使抗原成分沉淀的方法。最常用盐析法。 ③层析法—包括凝胶过滤、离子交换、亲和层析等，用于抗原等物质的精提～ 用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出。 凝胶过滤层析( 分子筛)的作用机理 亲和层析的作用机理 3）鉴定： 鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、 纯度以及免疫学活性。 蛋白的含量—定氮（紫外光280nm等） 分子的质量—电泳、质谱 蛋白的纯度—电泳、高效液相层析 免疫学活性—免疫双扩散、免疫印迹 3、半抗原性免疫原的制备 半抗原（hapten） 蛋白质等载体（carrier） 连接—物理法：即利用电荷和微孔吸附