生物信息学PCR引物设计要点.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 查看DNAMAN的结果 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 发现前面Blast比对的第一条结果就是原序列 * * * * * * 3、进入blastn界面 GCCAGTTCTGATATTTACACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAATGAAATCCAGTACGCTTC （1）输入上下游引物序列，都从5→3，中间用20个以上的N隔开 Others （2）在Database选中Others数据库 Somewhat similar sequences Show results in a new window打钩 Algorithm parameters Expect threshold Word size Expect值越高，匹配到的结果序列越多 Word-size，字长。 BLAST 的字长缺省值为 11，即 BLASTN 将扫描数据库，直到发 现那些与未知序列的 11 个连续碱基完全匹配的11 个连续碱基长度片段为止。降低字长能增加搜索到的结果。 基因 找到了目的基因，可见引物的正确性没有问题。 五、使用Primer – BLAST工具快速设计引物 Primer – BLAST为NCBI开发的一款引物在线设计工具，将引物设计和序列比对一步完成，从而快速筛选获得的引物。 上传模板序列 如果你已经设计好了引物，可以来验证引物的好坏。这里是引物设计，所以不用填 对上传的模板序列返回10对引物 设定Tm值 选择引物比对的数据库和物种 搜索的结果 对每对引物进行分析后，根据实验需求选择合适的引物用于合成，然后进行PCR。 注意： 在选择数据库时，BLAST提供了4种数据库：RefSeq mRNA, Genome (selected reference assemblies), Genome (all chromosomes), and nr (the standard non-redundant database)。前两个数据库是经过专家注释的数据，这样可以给出更准确的结果。 一些Tips 1，在任何时候都要优先使用参考序列的Gi号或Accession 号（尽量不要Fasta格式的序列）。另外，确保你的序列是最新版本的（在填Accession Number时后面不加版本号就会自动拿最新的序列） 2，就算你对整个序列的某部分感兴趣（如某条染色体上的某个区域），你也应该优化使用Gi号或Accession 号（Primer-BLAST有参数可以设置设计引物的范围，”Form-To”）。因为用Gi号或Accession 号，NCBI会自动读取该序列的一些注释数据，对引物的设计更加有利。 3，尽量使用没有冗除的数据库（如refseq_rna 或 genome database），nr数据库包括了太多的冗除的序列，会干扰引物的设计。 4，请指定一个或几个PCR扩增的目标物种。如果不指定在所有的物种搜索，将会使程序变得很慢，引物的结果也会受其它不相关的物种影响。 小结 一、引物设计流程 （1）序列查找和下载 GenBank数据库 （2）同源性比较 获取高度保守的序列，PCR引物应位于其中 （3）引物设计与筛选 Primer Premier、Oligo、Primer-BLAST 小结 一、引物设计流程 （4）引物加工与修饰 酶切位点、特异性标签 （5）引物评价分析 Oligo （6）引物二次筛选 BLAST （7）进行PCR实验做最终评估 小结 二、引物设计原则 （1）引物长度 18~27 bp （2）引物特异性 引物应位于保守区内（做模板同源性比对） （3）引物碱基分布 3’端避免出现GGG、CCC，末端避免出现A 小结 二、引物设计原则 （4）引物互补情况 二聚体和发夹结构的ΔG4.5 kcal/mol （5）引物修饰情况 5’端引入修饰位点，但仅在计算Tm时不考虑 （6）产物二级结构 用其它软件预测待扩增的产物 小结 二、引物设计原则 （7）引物GC含量 40%~60%，上下游不能相差太大，可在5’端加G、C或A、T进行调整 （8）引物Tm值 72℃最佳 （9）引物ΔG 3’端ΔG绝对值9 （10）密码子的简并 扩增编码区时，3’端不要终止于第三位密码子 补充：产物的二级结构预测 找到扩增的产物序列（Oligo7给出的第一条结果145 bp）： GCCA GTTCT GATAT TTACA CCA