生分子生物学实验讲义材料.docVIP

实验 人外周血淋巴细胞总RNA的提取、电泳 一、实验目的 学习并掌握总RNA的分离提取及方法。 二、实验原理 的总RNA主要由rRNA、tRNA及mRNA组成，其中rRNA含量最多（占80%~85％）。在pH 6.0微酸环境下，RNA相对稳定，碱性环境下，易分解。 RNA酶极为稳定且广泛存在于细胞内外，环境中存在大量RNA酶，极易降解RNA，因而在RNA提取及相关分析实验中，如何避免RNA酶的污染及抑制内源和外源性RNA活性,是实验成败的关键。 在RNA相关实验过程中，须树立RNase-free思想：1）样品新鲜，保存得当，以强变性剂，防止内源性RNase；2）人体上遍布RNase,养成操作时勤换一次性手套和口罩的好习惯；3）空气中灰尘和细菌含RNase，应建立干净的操作环境； 实验介绍如何使用lus试剂来分离总RNA。 lus是一种酸性苯酚提取试剂，含有去垢剂，和使RNase失活的异硫氰酸胍，它能在破碎和溶解细胞时保持RNA的完整性，防止RNA降解。（注意：lus具有强烈腐蚀作用，小心操作。） 三、实验材料、试剂与器材 1、细胞（5х106） 2、DEPC水溶液，PBS，TAE 3、氯仿，异丙醇，乙醇均为分析纯 4、lus试剂购自 5、RNase的枪头（1000、200、20 ul），离心管 (0.2ml、0.5ml PCR管 ,1.5ml、2ml、7ml离心管)。 四、实验步骤 1.RNA提取前的准备 ）、塑料制品的处理： 0.05-0.1%的DEPC （焦碳酸二乙酯水）浸泡过夜： 必须保证塑料制品被水浸透，内部没有气泡，对于小枪头、0.2ml、0.5ml PCR管，必要时应用枪逐个的用水灌注（这一步对于以后的实验保证非常重要，须小心操作）。 泡过夜后，用镊子逐个敲去管内的DEPC水，装于干烤过的烧杯，加锡箔纸密封杯口；尽量敲去枪头内的水，装于处理过的枪头盒，报纸包好。 121℃，30分钟高压灭菌，以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性，且抑制后继酶促反应，烘干，备用。 DEPC是蛋白质强变性剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。具强挥发性，致癌物,因而使用时应在通风橱操作，需戴一次性手套，一次性口罩，小心操作。 ）、试剂的配制： 试验所用试剂也可用DEPC处理过夜，再高压灭菌,但 DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理，可用DEPC处理的水配制，并尽可能用未曾开封的试剂，然后高压灭菌。 所需烧杯等必须干烤处理以后方可用。 0.05-0.1‰的DEPC水（三蒸水），磁力搅拌器搅拌过夜或者摇床低速振荡过夜，121℃，30分钟高压灭菌。 2.RNA的提取： 5х106个体外培养的PBMC悬液置于EP管中，离心收集细胞沉淀 向中加入ml RNAiso Plus裂解细胞， 室温（15-30℃）静置 5 分钟，然后从核蛋白中分离 RNA 加入氯仿（RNAiso Plus 的 1/5 体积量），盖紧离心管盖，混合至溶 液乳化呈乳白色，室温 12,000 g 4℃离心 15 分钟。从离心机中小心取出离心管，此时溶液分为三层， 即：无色的上清液（含 RNA） 、中间的白色蛋白层（大部分为 DNA）及带有颜色的下层有机相。 小心吸取上层无色水样层转移至一新EP管中 12000g，4oC离心10min，轻轻倒去上清 加入乙醇洗涤RNA沉淀一次，7500r/min，4oC离心5min 弃上清，倒置EP管，5-10min空气干燥（勿完全干躁，难再溶），加入20ul的DEPC水注意：异硫氰酸胍是很强的蛋白变性剂，但它不能使RNA酶发生不可逆失活。因此，假如去蛋白后，样本被残余的RNA酶污染，这些酶会在变性剂去除后，重新恢复活性。因此，将水相中RNA彻底从有机相中分离出，并避免通过脏的容器和手套重新被蛋白污染，这点很重要。 3、琼脂糖凝胶电泳检测 1）、3%过氧化氢浸泡电泳槽、胶板、梳子30分钟以上后，以DEPC处理的水冲洗，备用； 2）、以DEPC处理的水稀释50хTAE（DEPC处理的水配制，高压灭菌）为1хTAE备用； 3）、用以上1хTAE配制1%琼脂糖凝胶电泳胶； 4）、电泳 5V/cm 电泳20min 5）、电泳图谱：28s和18 s条带清晰、28s亮度是18s亮度的2倍以上实验 反转录-聚合酶链式反应 （RT-PCR）17基因 实验目的 通过本实验掌握RT-PCR工作原理及操作方法。 实验原理 逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR) 是间接对某一特定的RNA分子的扩增，可分作相对独