第2章DNA重组(3DNA片段的连接重组)研究.pptVIP

第二章 DNA重组 4 DNA的化学合成与DNA的凝胶电泳 自学为主 5 DNA片段的连接重组 5.1 DNA连接酶的发现 1967年，世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶(ligase)。 这种酶需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基(-OH)，和在另一条DNA链的5’-末端具有一个磷酸基团(-P)，只有在这种情况下，才能发挥其连接DNA分子的功能作用 5.2 DNA连接酶的基本性质 修复双链DNA上切口处的磷酸二酯键 修复与RNA链结合的DNA链上切口处的磷酸二酯键 连接多个平头双链DNA分子 5.3 分类 5.4 DNA连接酶的反应体系 连接酶连接切口DNA的最佳反应温度是37℃。但是在这个温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的。因此，连接粘性末端的最佳温度，应是界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为4~15℃比较合适。 平末端的连接采用T4DNA聚合酶，可在较高的温度进行，如22 ℃。 5.5 体外连接DNA片段的方式 同种内切酶产生的粘性末端的连接 同尾酶产生的粘性末端的连接 不同粘性末端的连接 5.5.1同种内切酶产生的粘性末端的连接 5.5.2同尾酶产生的粘性末端的连接 5.5.3不同粘性末端的连接 5.5.4平末端的直接连接 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于